miR—205—5p對鼻咽癌細胞系增殖、遷移和侵襲的影響及其機制

[摘要] 目的 觀察微小RNA miR-205-5p對鼻咽癌（NPC）細胞系HONE1增殖、遷移和侵襲的影響，探討其作用機制。方法 將人工合成的miR-205-5p模擬物、抑制物及相應(yīng)陰性對照轉(zhuǎn)染至HONE1細胞中，用CCK-8法檢測細胞增殖，細胞劃痕實驗及Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲，Western blot檢測miR-205-5p潛在靶基因PTEN、Smad4以及PTEN下游基因蛋白激酶B（AKT）的表達水平。結(jié)果 與對照相比，miR-205-5p模擬物轉(zhuǎn)染細胞增殖、遷移和侵襲能力增強，PTEN和Smad4表達下降，磷酸化AKT（p-AKT）表達升高；而miR-205-5p抑制物轉(zhuǎn)染細胞增殖、遷移和侵襲能力減弱，PTEN和Smad4表達升高，p-AKT表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.970～8.011，P<0.05）。結(jié)論 miR-205-5p可促進NPC細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與靶向調(diào)控抑癌基因PTEN和Smad4表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 微RNAs；鼻咽腫瘤；細胞增殖；細胞運動；腫瘤侵潤

[中圖分類號] R739.63

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2018）03-0257-06

鼻咽癌（NPC）是我國較為常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其早期診斷困難且缺乏特異的腫瘤標志物，目前NPC的首選治療方法是放療，但對放療不敏感的病人極易復(fù)發(fā)[1-2]，因而尋找特異的腫瘤標志物對于NPC的診治至關(guān)重要。微小RNA（miRNA）是細胞內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，可通過與靶基因3′UTR互補結(jié)合，使靶mRNA降解或參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制而發(fā)揮生物學作用[3]。近年來，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及作為腫瘤防治標志物的研究備受關(guān)注[4]。miR-205在多種腫瘤中表達異常，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但miR-205在不同腫瘤中的表達和作用不同：miR-205可作為抑癌基因在乳癌[4]、前列腺癌[5]、腎癌[6]和黑色素瘤[7]等腫瘤中發(fā)揮作用，但也可作為癌基因參與肺癌[9]和子宮內(nèi)膜癌[10]的發(fā)生發(fā)展。有研究顯示，NPC組織中miR-205的表達高于鼻咽對照組織[11-13]，推測其在NPC發(fā)生發(fā)展過程中可能起癌基因的作用，但這還需要進一步的體內(nèi)外實驗驗證，而且miR-205在NPC中的作用機制尚不清楚。因此，本研究通過體外實驗觀察miR-205-5p對NPC細胞系HONE1增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其機制，從而為明確miR-205-5p參與NPC的作用機制及尋找NPC診斷、治療和預(yù)后判斷潛在標志物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系與試劑

NPC細胞系HONE1由廣東醫(yī)學院病理科朱偉教授贈予；miR-205-5p的模擬物、抑制物以及相應(yīng)陰性對照均由廣州銳博生物科技有限公司合成；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco公司）；LipofectamineTM2000、Trizol（美國Invitrogen公司）；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis以及Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR試劑盒（購自大連Takara公司）；CCK-8試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司）；基質(zhì)膠（美國BD公司）；Transwell chamber（美國康寧公司）；PTEN、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）和Smad4單克隆抗體（英國Abcam公司）；β-actin一抗、二抗（北京博奧生物有限公司）；Western顯色液（北京碧云天公司）。

1.2 miRNA轉(zhuǎn)染及表達檢測

根據(jù)miRBase上公布的人miR-205-5p核苷酸序列人工合成其模擬物、抑制物及相應(yīng)陰性對照序列。將HONE1細胞接種于6孔板，當細胞融合度達到80%以上時，以LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-205-5p 模擬物（miR-205 mimics）及其對照（mimics NC），miR-205-5p抑制物（miR-205 inibitor）及其對照（inhibitor NC）。轉(zhuǎn)染24 h以后采用Trizol法提取各組細胞RNA，用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qRT-PCR檢測各組miR-205-5p表達水平，以U6作為內(nèi)參。以2-△△Ct表示實驗組與對照組的相對表達量，取3次實驗均值。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖

取miR-205 mimics、miR-205 inhibitor以及相應(yīng)對照轉(zhuǎn)染24 h的細胞，按每孔1×107/L的密度將細胞接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，并置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在培養(yǎng)后1～7 d，加入CCK-8溶液10 μL繼續(xù)孵育1 h，每組設(shè)5個復(fù)孔，用酶聯(lián)免疫檢測儀于波長450 nm處檢測吸光度。取3次實驗均值繪制細胞增殖曲線。

1.4 細胞劃痕實驗

于6孔板背部均勻畫水平線；收集各組對數(shù)期細胞，將細胞懸液密度調(diào)至7×107/L進行鋪板；待細胞匯合至95%以上時，用無菌槍頭垂直于水平線畫線，以PBS清洗3次后加入2 mL無血清DMEM培養(yǎng)液。在0、48 h時，于倒置顯微鏡下觀察拍照。使用Image J軟件測定劃痕的寬度并計算閉合率：48 h的閉合率=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。取3次實驗平均值。

1.5 Transwell細胞遷移和侵襲實驗

Transwell細胞遷移實驗：胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染24 h后的各組細胞，用不含血清的培養(yǎng)液洗2次并重懸細胞，使細胞密度達到3×108/L；取200 μL細胞懸液置于37 ℃預(yù)溫的Transwell小室，吸取含血清的完全培養(yǎng)液650 μL置于下室，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；孵育24 h后，以PBS洗小室，使用棉簽擦除微孔膜上側(cè)細胞，甲醇固定25 min，10 g/L結(jié)晶紫染色20 min，蒸餾水沖洗，在顯微鏡下觀察，取9個視野拍照并計數(shù)。Transwell細胞侵襲實驗：將基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)液按1∶6稀釋，將稀釋后的基質(zhì)膠80 μL鋪于上室，孵育6 h，其余步驟與Transwell細胞遷移實驗相同，48 h后觀察并統(tǒng)計細胞數(shù)目。取3次實驗平均值。

1.6 Western blot檢測PTEN、AKT和Smad4蛋白表達

收集轉(zhuǎn)染72 h后的細胞，提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白在100 g/L SDS-PAGE凝膠上電泳，總蛋白分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。于搖床上用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1～2 h（磷酸化蛋白使用牛血清清蛋白封閉，其余步驟相同），加入一抗（1∶1 000稀釋）4 ℃孵育過夜，采用TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000稀釋），室溫反應(yīng)2 h，以TBST洗膜3次。用發(fā)光試劑ECL（A液和B液）進行顯色，暗室曝光并保存圖片。應(yīng)用Image J軟件進行條帶灰度分析，目的蛋白相對表達量以目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.7 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SSPS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，組間比較采用t檢驗或t′檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染細胞中miR-205-5p的表達水平

miR-205 mimics組細胞中miR-205-5p的表達量比mimics NC組增加約90倍，過表達顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（t′=24.683，P<0.01）；miR-205 inhibitor組細胞中miR-205-5p表達量比inhibitor NC 組下降顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（t′=8.122，P<0.05）。見圖1A。

2.2 miR-205-5p對細胞增殖的影響

培養(yǎng)后2～6 d，miR-205 mimics組吸光度值高于mimics NC組，差異具有統(tǒng)計學意義（t=2.970～6.239，P<0.05）；培養(yǎng)后3～7 d，miR-205 inhibitor組吸光度值均低于inhibitor NC組，差異具有統(tǒng)計學意義（t=4.828～8.011，P<0.01）。見圖1B。

2.3 miR-205-5p對HONE1細胞遷移的影響

劃痕48 h時，與相應(yīng)對照組相比較，miR-205 mimics組細胞劃痕閉合率增加，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.950，P<0.05）；miR-205 inhibitor組細胞劃痕閉合率降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.482，P<0.05）。見圖2A、B。Transwell小室測定各轉(zhuǎn)染組細胞遷移情況，miR-205 mimics組遷移的細胞數(shù)高于mimics NC組，差異具有統(tǒng)計學意義（t=4.517，P<0.05）；miR-205 inhibitor組遷移的細胞數(shù)低于inhibitor NC組，差異亦具有統(tǒng)計學意義（t=4.047，P<0.05）。見圖2C、D。

2.4 miR-205-5p對HONE1細胞侵襲的影響

Transwell小室的細胞侵襲實驗顯示，miR-205 mimics組侵襲細胞數(shù)高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（t=4.818，P<0.01）；miR-205 inhibitor組侵襲細胞數(shù)低于對照組，差異亦具有統(tǒng)計學意義（t=4.441，P<0.05）。見圖2E、F。

2.5 miR-205-5p預(yù)測靶基因的蛋白表達水平

與相應(yīng)對照組相比，miR-205 mimics組細胞中PTEN蛋白表達下降，miR-205 inhibitor組細胞中PTEN蛋白表達升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（t=4.205、4.423，P<0.05）。與相應(yīng)對照組相比，miR-205 mimics組和miR-205 inhibitor組細胞中的AKT總蛋白表達水平均無明顯改變，但p-AKT在miR-205 mimics組細胞中的表達有顯著升高（t=4.252，P<0.05），在miR-205 inhibitor組細胞中的表達顯著下降（t=4.269，P<0.05）。與相應(yīng)對照組相比較，Smad4在miR-205 mimics組細胞中的表達顯著下降（t=3.773，P<0.05），而在miR-205 inhibitor組細胞中的表達顯著升高（t=3.133，P<0.05）。見圖3。

3 討論

有miRNA表達譜研究顯示，NPC組織中miR-205-5p的表達水平高于鼻咽正常組織或者非癌組織[9-11]。本研究體外細胞學實驗表明，miR-205-5p過表達可提高NPC細胞系HONE1增殖、遷移和侵襲的能力，而miR-205-5p表達下調(diào)可減弱細胞增殖、遷移和侵襲的能力。以往只有極少研究初步探討了miR-205-5p對NPC細胞系的作用，結(jié)果顯示miR-205-5p過表達可促進CNE2、6-10B和9-4E細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制細胞凋亡[14-15]；可增強CNE1細胞增殖和黏附[16]。上述體內(nèi)外研究均表明，miR-205-5p在NPC發(fā)病中可能起癌基因的作用，該作用與miR-205在子宮內(nèi)膜癌和肺癌中的作用類似[9-10，17-18]，但與在乳癌、腎癌、前列腺癌、黑色素瘤和頭頸部腫瘤（發(fā)生于口腔、口咽部、下咽部和喉部）等中的抑癌作用則不同，在這些腫瘤組織中miR-205表達下調(diào)[5-8，19]。由此可見，miR-205在腫瘤中所起的作用具有組織細胞特異性。miRNA在不同組織細胞中發(fā)揮不同作用，可能與其所處的細胞微環(huán)境不同有關(guān)，不同組織細胞類型的腫瘤都具有特異的miRNA表達譜[20]。

miRNA主要通過靶向抑制靶基因表達而發(fā)揮作用，本研究通過軟件預(yù)測miR-205-5p靶基因，選擇潛在靶基因PTEN和Smad4以及PTEN下游基因AKT在細胞學水平進行驗證。PTEN是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，主要通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌3-激酶（PI3K）/AKT信號通路發(fā)揮作用[21]。在本研究中，NPC細胞系HONE1中miR-205-5p過表達導(dǎo)致PTEN蛋白表達水平下降和p-AKT蛋白表達增加，而miR-205-5p表達下調(diào)導(dǎo)致PTEN蛋白表達水平升高和p-AKT表達減少，推測miR-205-5p可能通過靶向作用于PTEN使其表達下調(diào)，從而激活A(yù)KT，使HONE1細胞的增殖、遷移和侵襲能力增強。miR-205-5p對PTEN或PTEN/AKT的靶向調(diào)控作用在非小細胞肺癌細胞系[22]、子宮內(nèi)膜癌細胞系[10]和卵巢癌細胞系中亦得到驗證。

Smad4在1996年首次被確定為抑癌基因，其家族成員為轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號傳導(dǎo)過程中的轉(zhuǎn)錄因子，通過TGF-β調(diào)控與細胞生長和分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細胞周期、增殖、凋亡和分化。本研究miR-205-5p過表達HONE1細胞中Smad4的表達水平下降，而miR-205-5p表達下調(diào)HONE1細胞中Smad4蛋白表達水平則升高，推測miR-205-5p可通過直接作用于Smad4在HONE1細胞中發(fā)揮作用，是否通過作用于TGF-β信號通路尚需驗證。目前已有研究在肺癌[9]和卵巢癌[23]中驗證了miR-205-5p與Smad4之間的靶向關(guān)系，本研究首次在NPC細胞中驗證該靶向關(guān)系。

有少數(shù)研究對miR-205在NPC中的作用機制進行了探討，MAO等[12]的研究結(jié)果表明，miR-205-5p對CNE2細胞的促進增殖、遷移和侵襲作用與靶向調(diào)控PTEN/AKT信號通路相關(guān)；而NIE等[15]和LIU等[12]研究表明，miR-205-5p可分別靶向作用于抑癌基因p53誘導(dǎo)核蛋白1和多聚體免疫球蛋白受體參與NPC的發(fā)生發(fā)展。軟件預(yù)測及實驗研究顯示，miRNA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制復(fù)雜多變，一種miRNA可以調(diào)控多個靶基因，而一個靶基因也可被多個miRNA調(diào)節(jié)。因此，miR-205-5p參與NPC發(fā)生發(fā)展的機制還需要更深入研究，從而為NPC的診斷和治療提供新靶點。

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