MMP-7、TIMP-2在食管癌組織的表達(dá)及預(yù)后關(guān)系

朱曉磊， 朱自江， 王文昊， 龐瑤， 脫廣鑫

食管癌的主要治療方式是手術(shù)治療，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是外科醫(yī)生關(guān)注的焦點(diǎn)[1-3]。腫瘤根治術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因子參與的復(fù)雜的生物學(xué)過程，而它與腫瘤細(xì)胞與周圍間質(zhì)的相互作用、腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性以及患者自身的免疫狀態(tài)和腫瘤微環(huán)境等多個(gè)因素關(guān)系密切，其過程可涉及腫瘤抑癌基因或癌基因的失活或激活，腫瘤細(xì)胞與靶器官和機(jī)體的相互作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是一種肽鏈內(nèi)切酶，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了26種MMP，稱為MMP家族[4-5]。MMP家族高表達(dá)和高活性現(xiàn)象在所有腫瘤組織中均被發(fā)現(xiàn)[6-9]。組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP) 是MMP家族的特異性抑制劑，可抑制MMP家族的活動(dòng)和分解活性[10-12]。MMP/TIMP是否與食管癌術(shù)后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)，目前尚無定論?；诖耍覀兺ㄟ^檢測(cè)MMP-7和TIMP-2在食管癌術(shù)后生存時(shí)間>5年和<1年患者中表達(dá)情況，來探討MMP-7和TIMP-2表達(dá)量與食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集甘肅省人民醫(yī)院胸外科2010年1月至2013年1月食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)的臨床資料，篩選出生存時(shí)間>5年和<1年患者。從病理科借取納入患者石蠟標(biāo)本，此外借取同期62例正常對(duì)照標(biāo)本(距食管腫瘤≥3 cm正常食管組織)。邀請(qǐng)2位資深病理學(xué)醫(yī)生獨(dú)立復(fù)習(xí)HE切片，明確病理學(xué)診斷，若診斷結(jié)果不一致，由第3位病理學(xué)醫(yī)生參與確定。排除術(shù)前放化療病例，共入組186例。分為兩組：A組為生存時(shí)間>5年124例；B組為生存時(shí)間<1年且死因?yàn)槭彻馨?fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移62例。A、B兩組一般資料見表1?；颊吣[瘤大小、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)、根治程度、殘端情況、TNM分期和病理分期，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；年齡、性別、腫瘤部位、吻合部位、術(shù)后有無放化療和吻合方式，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 生存時(shí)間>5年(A組)和生存時(shí)間<1年(B組)患者一般資料比較(例)

1.2 組織芯片制備

186例ESCC和62例正常食管組織標(biāo)本都用4%甲醛固定，再用石蠟包埋，切片厚4 μm，用HE染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察，ESCC癌組織選取腫瘤細(xì)胞形態(tài)完整組織，正常食管組織選取鱗狀上皮，用記號(hào)筆分別進(jìn)行定位，再對(duì)照相應(yīng)供體蠟塊進(jìn)行定位和標(biāo)記。載體蠟塊制備：取萊卡石蠟(97.5g)+蜂蠟(2.5g)溶化后，注入35 mm×27 mm×9 mm載體蠟塊模具中。設(shè)計(jì)組織微陣列：用組織芯片制備儀打孔針在載體石蠟上打出間距為1.0 mm，直徑0.6～0.8 mm，深度為4 mm的孔，設(shè)計(jì)成9×7陣列。組織芯轉(zhuǎn)移：用采樣針獲取已標(biāo)記組織芯(組織芯直徑為0.6～0.8 mm)，每個(gè)組織芯之間間距0.2 mm，按隨機(jī)排列方法把已獲取的組織芯打入載體石蠟中，左上角用一空白孔建立坐標(biāo)標(biāo)識(shí))。每例ESCC標(biāo)本組織取3～5個(gè)點(diǎn)，共844點(diǎn)，每例正常食管組織取3個(gè)點(diǎn)，共取186點(diǎn)，制備1 030個(gè)觀測(cè)點(diǎn)。采用連續(xù)切片方法將載體石蠟切片，1張用HE染色，其余用3-氨丙基-三乙氧基硅烷(APES，SIGMA)硅化的載玻片裱片，并置于56 ℃烤箱中烘烤48 h做IHC染色。

1.3 免疫組化

1.3.1 主要儀器與設(shè)備 見表2。

表2 主要設(shè)備和儀器

1.3.2 第一抗體來源 見表3。

1.3.3 操作步驟 MMP-7、TIMP-2用LsAB法。用二甲苯將微陣列切片脫蠟，再用梯度乙醇脫水；阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用3%過氧化氫處理切片(25 min)，再蒸餾水洗滌(搖床，5 min×2次)；抗原修復(fù)：TIMP-2用EDTA高溫高壓法修復(fù)，MMP-7不需要修復(fù)；0.01 mm/L PBS洗滌(搖床，5 min×2次)；血清封閉：滴加非免疫羊血清(稀釋度1∶20)，用蓋玻片加封置于7 ℃孵育20 min；除去蓋玻片，用濾紙吸去血清；將第一抗體滴加后用蓋玻片加封，置于37 ℃孵育2 h；再用0.01 mm/L PBS洗滌(搖床，5 min×2次)；滴加生物素標(biāo)記羊抗鼠抗體(稀釋度1∶200)檢測(cè)MMP-7、TIMP-2的切片，置于37 ℃孵育45 min；再用0.01 mm/L PBS洗滌(搖床，5 min×2次)；滴加辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記鏈霉親和素復(fù)合物(稀釋度1∶200)，加蓋玻片置于37 ℃孵育45 min；0.01 mm/L PBS洗滌(搖床，5 min×2次)；用新鮮配置DAB染色液顯色，鏡下觀察適時(shí)終止后用自來水沖洗；用蘇木素復(fù)染(室溫，5 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)15 min)；用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠進(jìn)行封片。

1.4 染色結(jié)果判斷

選取染色質(zhì)量好的區(qū)域作為觀察區(qū)，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，分別請(qǐng)2名病理科主任醫(yī)師獨(dú)立對(duì)染色強(qiáng)度作評(píng)估，由第3位病理科醫(yī)生參與，最后綜合結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。MMP-7、TIMP-2定位在胞質(zhì)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分陰性(-)；1分弱陽性(+)；2分中等強(qiáng)度陽性(++)；3分強(qiáng)陽性(+++)。-～+為低表達(dá)和++～+++為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。A、B兩組間表達(dá)強(qiáng)度采用秩和檢驗(yàn)，組間陽性表達(dá)率比較采用χ2檢驗(yàn)，各指標(biāo)間以及與各臨床病理特征相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-7在食管癌組織中的表達(dá)情況

表3 第一抗體來源

MMP-7在食管正常鱗狀上皮基底層不表達(dá)；在A組食管癌組織中呈弱陽性表達(dá)；在B組食管癌組織呈中等以上陽性表達(dá)。見圖1。

圖1 MMP-7在食管癌組織中的表達(dá)1A：MMP-7在食管正常鱗狀上皮基底層不表達(dá)；1B：MMP-7在生存時(shí)間>5年食管癌組織中呈弱陽性表達(dá)；1C：MMP-7在生存時(shí)間<1年食管癌組織中呈中等陽性表達(dá)；1D：MMP-7在生存時(shí)間<1年食管癌組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)

2.2 食管癌組織MMP-7表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

MMP-7在A組中的表達(dá)強(qiáng)度低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。A組患者腫瘤組織MMP-7表達(dá)率為85.5%(106/124)，高表達(dá)率為27.4%(34/124)；B組腫瘤組織MMP-7表達(dá)率為93.5%(58/62)，高表達(dá)率為56.5%(35/62)，見表4。A組MMP-7高表達(dá)率低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.930，P<0.001)。

表4 生存時(shí)間>5年(A組)和生存時(shí)間<1年(B組)MMP-7表達(dá)情況(例)

2.3 TIMP-2在食管癌組織中的表達(dá)情況

TIMP-2在食管正常鱗狀上皮基底層不表達(dá)；在A組食管癌組織中呈弱陽性表達(dá)； 在B組食管癌組織中呈中等以上陽性表達(dá)。見圖2。

圖2 TIMP-2在食管癌組織中的表達(dá)情況2A：TIMP-2在食管正常鱗狀上皮基底層不表達(dá)；2B：TIMP-2在生存時(shí)間>5年食管癌組織中呈弱陽性表達(dá)；2C：TIMP-2在生存時(shí)間<1年食管癌組織中呈中等陽性表達(dá)；2D：TIMP-2在生存時(shí)間<1年食管癌組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)

2.4 食管癌組織中TIMP-2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

TIMP-2在A組中的表達(dá)強(qiáng)度低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。A組患者腫瘤組織TIMP-2表達(dá)率為87.1%(108/124)，高表達(dá)率為22.2%(25/124)；B組腫瘤組織TIMP-2表達(dá)率為98.3%(61/62)，高表達(dá)率為40.3%(25/62)，見表5。A組中TIMP-2高表達(dá)率低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.014，P=0.045)。

表5 生存時(shí)間>5年(A組)和生存時(shí)間<1年(B組)TIMP-2表達(dá)情況(例)

3 討論

惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是多個(gè)因素參與的復(fù)雜的生物學(xué)過程。癌細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶具有降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的能力，而此能力和癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究證實(shí)，TIMP家族是MMP家族天然抑制劑，它們?cè)隗w內(nèi)存在著一種動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)系，這種關(guān)系對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)起著舉足輕重的作用，若平衡被破壞就會(huì)引起食管鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

MMP-7 是MMP家族中重要成員之一，可降解各種細(xì)胞外基質(zhì)成分(層粘連蛋白、彈性蛋白、Ⅳ型膠原蛋白等)。多項(xiàng)研究顯示，MMP-7與食管癌、胃賁門癌、非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌等腫瘤相關(guān)，與MMP-7啟動(dòng)子區(qū)域多態(tài)性有關(guān)[13-17]。Shibata-Kobayashi等[18]發(fā)現(xiàn)，MMP-7 mRNA在食管癌表達(dá)水平高于正常食管鱗狀上皮細(xì)胞。Yoshinaga等[19]報(bào)道，食管癌患者腫瘤侵及深度以及靜脈受侵情況與MMP-7表達(dá)水平高低有關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)生存時(shí)間短的食管癌患者M(jìn)MP-7表達(dá)陽性，生存時(shí)間長的食管癌患者M(jìn)MP-7表達(dá)陰性。我們研究發(fā)現(xiàn)，MMP-7在A組的表達(dá)強(qiáng)度低于B組，A組MMP-7表達(dá)率及高表達(dá)率均低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在分組時(shí)發(fā)現(xiàn)：A、B組患者腫瘤的大小、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的個(gè)數(shù)、根治程度、殘端情況、TNM分期和病理分期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。推測(cè)MMP-7表達(dá)與食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)連續(xù)過程，多基因協(xié)同假說認(rèn)為機(jī)體內(nèi)抑癌基因的失活或沉默、癌基因激活或增強(qiáng)在癌細(xì)胞的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段起著不同作用，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及浸潤和轉(zhuǎn)移。正常情況下，體內(nèi)MMP家族降解的潛能和活性都受到TIMP-2的抑制，而TIMP-2又很少受細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，因此，存在著一種動(dòng)態(tài)平衡[20-22]。在正常人體中，MMP-7與TIMP-2的動(dòng)態(tài)平衡，保證了機(jī)體生理狀態(tài)下的細(xì)胞遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)的重建，使得基底膜完整性得到保證，能很好限制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而這種平衡被打破，就可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移并影響患者的生存期[23]。本研究中，B組患者M(jìn)MP-7表達(dá)強(qiáng)度高，表達(dá)率及高表達(dá)率均高于A組， TIMP-2亦如此。推測(cè)食管癌組織中基底膜的破壞能導(dǎo)致MMP-7與TIMP-2平衡打破，MMP-7高表達(dá)和過度分泌，導(dǎo)致TIMP-2高表達(dá)和過度分泌[24-26]。

綜上所述， MMP-7/TIMP-2可作為評(píng)估食管癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。同時(shí)，可將MMP-7作為食管癌治療的靶點(diǎn)。Miyazaki等[27]在結(jié)腸癌的動(dòng)物模型中，用MMP-7反義寡聚核苷酸來干預(yù)MMP-7表達(dá)和陽性表達(dá)量從而干預(yù)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，取得較好結(jié)果，但臨床療效尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Varghese TK， Hofstetter WL， Rizk NP， et al. The society of thoracic surgeons guidelines on the diagnosis and staging of patients with esophageal cancer[J]. Ann Thorac Surg， 2013，96(1)：346-356.

[2] Berry MF. Esophageal cancer： staging system and guidelines for staging and treatment[J]. J Thorac Dis， 2014，6 Suppl 3：S289-297.

[3] Mao Y， He J， Gao S， et al. Controversies in the surgical treatment for esophageal carcinoma and future investigation[J]. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi， 2015，18(9)：851-854.

[4] Zeng GQ， Chen AB， Li W， et al. High MMP-1， MMP-2， and MMP-9 protein levels in osteoarthritis[J]. Genet Mol Res， 2015，14(4)：14811-14822.

[5] Ahmed HOA， Haglund C， Virolainen S， et al. MMP-7， MMP-8， and MMP-9 in oral and cutaneous squamous cell carcinomas[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol， 2015，119(4)：459-467.

[6] Vosseler S， Lederle W， Airola K， et al. Distinct progression-associated expression of tumor and stromal MMPs in HaCaT skin SCCs correlates with onset of invasion[J]. Int J Cancer， 2009，125(10)：2296-2306.

[7] Wu T， Li Y， Lu J， et al. Increased MMP-21 expression is associated with poor overall survival of patients with gastric cancer[J]. Med Oncol， 2013，30(1)：323.

[8] Shi H， Liu L， Liu LM， et al. Inhibition of tumor growth by β-elemene through downregulation of the expression of uPA， uPAR， MMP-2， and MMP-9 in a murine intraocular melanoma model[J].Melanoma Res，2015，25(1)：15-21.

[9] Shi CH， Wang WS， Zhang ZD， et al. Effect of lentivirus-mediated uPA silencing on the proliferation and apoptosis of chondrocytes and the expression of MMPs[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci， 2015，35(1)：111-116.

[10] Dossi R， Frapolli R， Di GS， et al. Antiangiogenic activity of trabectedin in myxoidliposarcoma： involvement of host TIMP-1 and TIMP-2 and tumor thrombospondin-1[J]. Int J Cancer， 2015，136(3)：721-729.

[11] Groblewska M， Siewko M， Mroczko B， et al. The role of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TIMPs) in the development of esophageal cancer[J]. Folia Histochem Cytobiol， 2012，50(1)：12-19.

[12] Ozden F， Saygin C， Uzunaslan D， et al. Expression of MMP-1， MMP-9 and TIMP-2 in prostate carcinoma and their influence on prognosis and survival[J]. J Cancer Res Clin Oncol， 2013，139(8)：1373-1382.

[13] Al-Alem LF， McCord LA， Southard RC， et al. Activation of the PKC pathway stimulates ovarian cancer cell proliferation， migration， and expression of MMP7 and MMP10[J]. Biol Reprod， 2013，89(3)：73.

[14] Zhu R， Tian Y. Astrocyte elevated gene-1 increases invasiveness of NSCLC through up-regulating MMP7[J]. Cell Physiol Biochem， 2015，37(3)：1187-1195.

[15] Safranek J， Holubec L， Topolcan O， et al. Expression of mRNA MMP-7 and mRNA TIMP-1 in non-small cell lung cancer[J]. Anticancer Res， 2007，27(4C)：2953-2956.

[16] Zhou JH， Zhang B， Kernstine KH， et al. Autoantibodies against MMP-7 as a novel diagnostic biomarker in esophageal squamous cell carcinoma[J]. World J Gastroenterol， 2011，17(10)：1373-1378.

[17] Bornschein J， Seidel T， Langner C， et al. MMP2 and MMP7 at the invasive front of gastric cancer are not associated with mTOR expression[J]. Diagn Pathol， 2015，10：212.

[18] Shibata-Kobayashi S， Yamashita H， Okuma K， et al. Correlation among 16 biological factors[p53， p21(waf1)， MIB-1 (Ki-67)， p16(INK4A)， cyclin D1， E-cadherin， Bcl-2， TNF-α， NF-κB， TGF-β， MMP-7， COX-2， EGFR， HER2/neu， ER， and HIF-1α] and clinical outcomes following curative chemoradiation therapy in 10 patients with esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncol Lett，2013，5(3)：903-910.

[19] Yoshinaga K， Mimori K， Inoue H， et al. Activin A enhances MMP-7 activity via the transcription factor AP-1 in an esophageal squamous cell carcinoma cell line[J]. Int J Oncol， 2008，33(3)：453-459.

[20] Yu TS， Li Z， Zhao R， et al. Time-dependent Expression of MMP-2 and TIMP-2 after Rats Skeletal Muscle Contusion and Their Application to Determine Wound Age[J]. J Forensic Sci， 2016，61(2)：527-533.

[21] Kolude B， Adisa AO， Lawal AO， et al. Stoichiometric expression of MMP-2/TIMP-2 in benign and malignant tumours of the salivary gland[J]. TumourBiol， 2015，36(4)：2351-2357.

[22] Zhu W， Sun W， Zhang J T， et al. Norcantharidin enhances TIMP-2 anti-vasculogenic mimicry activity for human gallbladder cancers through downregulating MMP-2 and MT1-MMP[J]. Int J Oncol， 2015， 46(2)： 627-640.

[24] Kovatsi L， Batzios S， Nikolaou K， et al. Alterations in serum MMP and TIMP concentrations following chronic heroin abuse[J]. Toxicol Mech Methods， 2013，23(5)：377-381.

[25] Brun JL， Cortez A， Lesieur B， et al. Expression of MMP-2，-7，-9， MT1-MMP and TIMP-1 and-2 has no prognostic relevance in patients with advanced epithelial ovarian cancer[J]. Oncol Rep， 2012，27(4)：1049-1057.

[27] Miyazaki K， Koshikawa N， Hasegawa S， et al. Matrilysin as a target for chemotherapy for colon cancer： use of antisense oligonucleotides as antimetastatic agents[J]. Cancer ChemotherPharmacol， 1999，43 Suppl：S52-55.