基于短刺小克銀漢霉的芍藥苷轉化芍藥內酯苷研究

施敏，馬曉彤，曹學麗，裴海閏，韓天，鄭積敏

芍藥是我國傳統(tǒng)的中藥材，具有多種藥理作用[1]，廣泛應用于保健食品、醫(yī)藥等領域[2]。芍藥內酯苷和芍藥苷是其中主要的活性成分[3]，但兩者在藥理作用上有較明顯差別[4]。芍藥內酯苷具有抗抑郁作用[5]，在促進睡眠、保護腦神經的藥理活性甚至超過了芍藥苷[6]，此外其在鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、調節(jié)免疫力、舒張平滑肌、抗炎、殺滅病原微生物和保護肝臟方面具有顯著作用[7]。芍藥苷和芍藥內酯苷互為同分異構體[8]，且在大多數(shù)芍藥品種中，芍藥苷的含量顯著高于芍藥內酯苷[9]。在芍藥內酯苷抗抑郁藥物的研發(fā)中，不僅需要采用高效的分離手段對兩者進行分離，分離出來的芍藥苷棄之不用造成資源的大量浪費[10]。所以，我們想到如果能利用微生物轉化的方法將芍藥苷轉化為芍藥內酯苷，一方面可以降低雙苷分離的難度，另一方面可以極大地提高資源的綜合利用度。目前，這方面的研究較少，劉鑫鑫等[11]曾對芍藥苷和芍藥內酯苷的微生物轉化進行過初步研究。從 18 種真菌中篩選出分別對芍藥苷和芍藥內酯苷具有轉化能力的菌株，其中短刺小克銀漢霉（Cunninghamella blakesleeanaAS 3.910）、雅致小克銀漢霉、華根霉可以將芍藥苷轉化為芍藥內酯苷，但并沒有深入研究各個菌種的轉化能力。本研究在此基礎上，就真菌短刺小克銀漢霉轉化芍藥苷為芍藥內酯苷的影響因素進行了系統(tǒng)考察，以芍藥苷的轉化率和芍藥內酯苷的產率為考察指標，對轉化工藝進行了優(yōu)化。構建了較高效的微生物轉化體系，提高了短刺小克銀漢霉對芍藥苷的轉化能力，為進一步研究奠定了良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 短刺小克銀漢霉干粉購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號為 CICC40267。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液（取新鮮去皮馬鈴薯 200 g，切成小塊，加水 1.0 L，煮沸 30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補至 1.0 L）1.0 L、葡萄糖 20.0 g、瓊脂15.0 g、自然 pH，121 ℃ 滅菌 15 min，放置于干凈的工作臺中，常溫冷卻凝固。 基礎培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液 100 ml、葡萄糖 2 g、自然 pH，121 ℃ 滅菌 15 min[12]。

1.1.3 底物 純度為 96% 的芍藥苷粉末由實驗室自行制備，配制成 10 mg/ml 的底物甲醇溶液。

1.1.4 試劑 馬鈴薯（市售）；葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；無水甲醇、無水乙醇、正丁醇、正己烷均為分析純，購于北京化工廠；煙酸（國家藥品標準物質）購自中國食品藥品檢定研究院；蛋白胨購自北京奧博星生物技術有限責任公司；甲醇為色譜級，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.1.5 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀為美國安捷倫科技有限公司產品；HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱為蘇州培英實驗設備有限公司產品；MJP-250 霉菌培養(yǎng)箱為上海精宏實驗設備有限公司產品；1312 SCL 超凈臺為北京賽伯樂實驗儀器有限公司產品；MLS-3020 高壓蒸汽滅菌鍋為日本Sanyo 電器集團產品；FiveEasy Plus pH 計為梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；D-3750 離心機為美國 Sigma公司產品；UB202i 正置生物顯微鏡為重慶奧浦光電技術有限公司產品；XB.K.25 血球計數(shù)板為上海醫(yī)用光學儀器廠產品。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與菌種孢子液的制備 將購買的短刺小克銀漢霉（AS3.910）菌種干粉用 5 ml 無菌水溶解，接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，在溫度為 28 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌體產生明顯的菌絲，然后再將菌絲接入新的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，活化 3 次后得到活力較為旺盛的菌體?；罨蟮木w，接種至馬鈴薯平板培養(yǎng)基上，在 28 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲生長旺盛且孢子豐富的時候，取出培養(yǎng)基，用20 ml 無菌水將平板上的孢子沖洗到無菌的三角瓶中，制成孢子液[13]。然后通過血球計數(shù)法，計數(shù)孢子液中的孢子個數(shù)[14]，從而確定接種量。

1.2.2 芍藥苷的轉化對照實驗 設定 1 個實驗組 1（菌體+ 芍藥苷底物 + 基礎培養(yǎng)基），將孢子液轉移到轉化瓶中（250 ml 的錐形瓶中裝 100 ml 的發(fā)酵培養(yǎng)基），采用振蕩培養(yǎng)的方式，在 28 ℃ 培養(yǎng) 72 h；然后加入 10 mg/ml的芍藥苷甲醇溶液 1 ml，使藥物濃度為 1 mg/ml，轉化反應持續(xù) 192 h。加入底物后，每隔 24 小時取 1 ml 的發(fā)酵液（菌體經 HPLC 檢測發(fā)現(xiàn)并無芍藥苷與芍藥內酯苷），7000 r/min 離心 10 min，取上清液，過濾后，進行 HPLC 分析。初步考察菌體的轉化率、產率及轉化時間。同時設計2 個對照實驗：對照組 1（菌體 + 基礎培養(yǎng)基），考察菌體僅在培養(yǎng)基存在下，是否產生芍藥內酯苷；對照組 2（芍藥苷底物 + 基礎培養(yǎng)基），考察芍藥苷底物在培養(yǎng)基中是否自動轉化成芍藥內酯苷。實驗組的實驗條件也是單因素實驗的基礎發(fā)酵條件。

1.2.3 轉化效果的評價方法 HPLC 分析條件：色譜柱為Zorbax SB-C18（200 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇:0.2% 磷酸水 = 30:70（V/V）；流速 1 ml/min；洗脫時間 10 min；柱溫 30 ℃；進樣量 10 μl；檢測波長 230 nm。轉化效果用芍藥內酯苷的產率和芍藥苷的轉化率雙指標進行評價。分別建立芍藥苷與芍藥內酯苷的標準曲線，通過標準曲線確定轉化前后芍藥苷與芍藥內酯苷的濃度。計算公式如下：

式中，Ca1為芍藥內酯苷轉化前的濃度；Ca2為芍藥內酯苷轉化后的濃度；CP1為芍藥苷轉化前的濃度；CP2為芍藥苷轉化后的濃度。

1.2.4 影響轉化效果的單因素實驗 在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，本研究考察了添加不同的輔助成分蛋白胨（1、2、3、4、5 g/L）、無機鹽 NaCl（1、2、3、4、5 g/L）、煙酸（0.1、0.2、0.4、0.5、0.6 g/L）等和不同培養(yǎng)條件，如最適 pH（4、5、6、7、8），轉化時間（24、48、72、96、120、144、168、192 h），底物溶媒（甲醇、50% 甲醇-水、水、乙醇），搖床轉速（150、200、250、300 r/min），接種量（1%、3%、5%、7%）、底物濃度（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/L）以及菌株培養(yǎng)時間（24、36、48、60、72、84 h）對產率及轉化率的影響。

1.2.5 轉化條件的正交試驗優(yōu)化 在單因素實驗的基礎上，選定菌種培養(yǎng)時間、底物濃度、蛋白胨濃度、煙酸濃度作為正交實驗的 4 個因素，每個因素各自選擇 3 個水平，忽略因素之間的相互作用，采用 L9(34) 正交試驗設計（表 1）確定最佳轉化條件。

表1 芍藥苷轉化條件的正交優(yōu)化實驗設計

2 結果

2.1 標準曲線的建立

首先對芍藥苷與芍藥內酯苷的對照品進行檢測，得到 HPLC 色譜圖（圖 1），由圖可知芍藥苷的出峰時間為6.4 min，芍藥內酯苷的出峰時間為 4.4 min。

圖1 芍藥內酯苷（1）和芍藥苷（2）對照品的 HPLC 圖

分別配制不同濃度梯度的芍藥苷和芍藥內酯苷，利用HPLC 測定不同濃度下的芍藥苷與芍藥內酯苷的峰面積，建立兩者的標準曲線（圖 2 和圖 3）。

圖2 芍藥內酯苷的標準曲線

圖3 芍藥苷的標準曲線

2.2 對照實驗結果

對實驗組與對照組轉化前后的樣品進行分析。由對照組 1 的結果發(fā)現(xiàn)，短刺小克銀漢霉不能在沒有底物的情況下自行代謝出芍藥內酯苷，轉化菌體的發(fā)酵產物和培養(yǎng)基的殘留成分對轉化結果不會有影響（圖 4）；根據對照組 2 的結果，芍藥苷不能在無菌種的發(fā)酵液中直接轉化為芍藥內酯苷，發(fā)酵液中不存在非生物對該轉化反應的干擾（圖 5）；實驗組 1 的結果表示在菌體、底物和培養(yǎng)基共存時，該菌體具有將芍藥苷轉化為芍藥內酯苷的作用（圖 6）。

圖4 對照組 1（菌體 + 培養(yǎng)基）的 0 h 取樣（A）與168 h 取樣（B）的 HPLC 色譜圖

圖5 對照組 2（底物 + 培養(yǎng)基）的 0 h 取樣（A）與168 h 取樣（B）HPLC 圖（1：芍藥內酯苷；2：芍藥苷）

通過對實驗組 1 不同培養(yǎng)時間的取樣分析（圖 7）可見，隨著轉化時間的延長，芍藥內酯苷的產率和芍藥苷的轉化率均不斷提高，在 168 h 達到產率（5.43 ± 0.12）% 與轉化率（11.39 ± 0.38）% 的高值，之后出現(xiàn)下降趨勢。因此，初步確定轉化時間為 168 h。

2.3 單因素對轉化效果的影響

圖6 實驗組 1（菌體 + 底物 + 培養(yǎng)基）0 h 取樣（A）與 168 h 取樣（B）HPLC 色譜圖（1：芍藥內酯苷；2：芍藥苷）

圖7 實驗組不同時間的取樣結果

2.3.1 培養(yǎng)基的影響 氮源、無機鹽和維生素等培養(yǎng)基成分會對菌體轉化能力產生一定的影響[15]，本研究主要考察了不同的蛋白胨濃度、NaCl 濃度、煙酸濃度下菌體的轉化能力，結果見圖 8 ～ 圖 10。從結果可知，在蛋白胨濃度為4 g/L，NaCl 濃度為 2 g/L，煙酸濃度為 0.3 g/L 時菌體有較好的轉化率和產率，其中蛋白胨濃度對轉化率和產率的影響較大。添加蛋白胨可以大幅提高轉化率，從（11.39 ±0.38）% 提高至（26.05 ± 1.52）%，但濃度過高時，轉化率有下降的趨勢。說明蛋白胨是短刺小克銀漢霉必要的營養(yǎng)物質，但對其添加量需要嚴格控制。

2.3.2 菌株的影響

2.3.2.1 菌株培養(yǎng)時間的影響 菌株培養(yǎng)時間指加入底物前菌種的培養(yǎng)時間[16]。菌體生長時間較短，由于還沒生長到生長代謝最旺盛的對數(shù)期，密度不夠，轉化率較低。菌種生長時間過長，密度雖然高，但菌體活力降低，故要選擇合適的菌株培養(yǎng)時間[17]。在發(fā)酵液接種后，分別在培養(yǎng) 24、36、48、60、72、84 h 再加底物，考察菌株培養(yǎng)時間對轉化率的影響，結果（圖 11）表明培養(yǎng)時間為 60 h 有較高的產率和轉化率。

圖8 培養(yǎng)基中蛋白胨濃度對菌株轉化能力的影響

圖9 培養(yǎng)基中 NaCl 濃度對菌株轉化能力的影響

圖10 培養(yǎng)基中煙酸濃度對菌株轉化能力的影響

2.3.2.2 菌株接種量的影響 菌種的添加比例對微生物發(fā)酵轉化有很大的影響[18]，主要影響微生物轉化啟動的時間[19]。將 28 ℃ 培養(yǎng) 7 d 的平板，用無菌水制成孢子懸浮液[20]，調整濃度，通過血球計數(shù)法得到濃度為 2 × 106個/ml的孢子原液。向 100 ml 的發(fā)酵液中加入 0.5、1.5、2.5 和3.5 ml 的孢子原液，達到設定接種量 1%、3%、5%、7%，以此考察不同接種量對短刺小克銀漢霉轉化芍藥苷為芍藥內酯苷能力的影響，結果見圖 12?？梢钥闯鼋臃N量為 3%時，有較好的轉化率與產率。

圖11 菌株培養(yǎng)時間對轉化效果的影響

圖12 不同接種量對轉化效果的影響

2.3.3 底物對轉化率的影響

2.3.3.1 底物濃度的影響 在微生物轉化體系中，底物濃度對菌體的轉化能力有著較明顯的影響[21]。所以，在基礎轉化與發(fā)酵條件下，向 100 ml 發(fā)酵液中分別添加 1、1.5、2、2.5 和 3 ml 的 10 mg/ml 的底物甲醇混合液。結果見圖 13，在設定的底物濃度范圍內，當?shù)孜餄舛葹?0.15 g/L時，芍藥苷有較好的轉化率（19.87 ± 1.07）%。超過 0.15 g/L時，轉化率呈現(xiàn)下降趨勢，這表明轉化體系的轉化能力有限，也反映出底物的細胞毒性可能會對轉化產生抑制。

2.3.3.2 溶媒的影響 底物在發(fā)酵液中的溶解能力較低是微生物轉化效率較低的主要原因[22]，因此，本實驗研究了不同溶媒對微生物轉化效率的影響。

由于有機溶劑對短刺小克銀漢霉的轉化能力有較大影響，分別用甲醇、50% 甲醇-水溶液、水以及乙醇等溶液溶解底物，考察不同溶媒對轉化率的影響，結果如圖 14 所示，用甲醇溶解底物，能使短刺小克銀漢霉有較好的轉化率和產率，所以選定甲醇作為芍藥苷的溶媒。

圖13 底物濃度對轉化效果的影響

圖14 溶媒對轉化效果的影響

2.3.4 發(fā)酵條件的影響

2.3.4.1 初始 pH 值的影響 pH 值的變化會引起菌體細胞通透性與酶活力的變化，并影響菌體對營養(yǎng)物質的利用率，從而影響菌體的生長及代謝活動。適當?shù)?pH 值將有利于短刺小克銀漢霉的菌體生長及菌種活力[23]，同時影響轉化效率。因此考察不同 pH 值對短刺小克銀漢霉轉化芍藥苷轉化率與芍藥內酯苷產率的影響，結果見圖 15。在 pH為 6 時，該菌有較好的轉化能力。

圖15 培養(yǎng)基 pH 值對芍藥苷內酯產率及芍藥苷轉化率的影響

2.3.4.2 轉速的影響 搖床轉速直接影響底物與菌體的接觸程度，同時影響催化反應中氧氣的供給[24]，本實驗考察了 150、200、250 和 300 r/min 4 個轉速條件下短刺小克銀漢霉對芍藥苷的轉化能力。由圖 16 可以看出，當搖床轉速為 250 r/min 時，該菌的催化效果最好，轉化率與產率較高；當轉速為 150 r/min 時，催化反應的氧氣供應不足，造成轉化產率大幅度下降[25]；當轉速為 300 r/min 時，該菌的轉化產率也較低，可能是因為轉速過高，菌體的生長與代謝受到較大影響，并且大部分的菌出現(xiàn)掛壁現(xiàn)象，從而影響了轉化率。所以，轉化的最適轉速為 250 r/min。

圖16 轉速對轉化效果的影響

實驗結果表明，影響轉化效果的因素有很多。綜合考慮，根據單因素實驗，對培養(yǎng)基中的煙酸濃度、NaCl 濃度、培養(yǎng)基初始 pH 值、搖床轉速、底物溶媒、接種量等因素進行了優(yōu)化定值，選取單因素條件下的最佳值作為后續(xù)的實驗條件。對涉及菌種、培養(yǎng)基、底物和轉化條件 4 方面的關鍵影響因素，包括菌株培養(yǎng)時間、蛋白胨濃度、底物濃度和轉化時間 4 個因素進行了進一步正交試驗優(yōu)化。

2.4 正交試驗對轉化條件的優(yōu)化

正交試驗結果見表 2，轉化效果最佳的條件：培養(yǎng)時間為 48 h，轉化時間的最好水平是 144 h，底物的最佳濃度為0.15 g/L，蛋白胨的最佳濃度為 5 g/L。

綜合單因素和正交試驗的結果，得出最佳的轉化工藝條件為：蛋白胨濃度 5 g/L，NaCl 濃度 2 g/L，煙酸濃度0.3 g/L，菌種培養(yǎng)時間 48 h，接種量 3%，培養(yǎng)基 pH 6，轉速 250 r/min，轉化時間 144 h，底物濃度 0.15 g/L，甲醇作為底物的溶媒。在優(yōu)化的轉化工藝條件下，進行 3 次驗證實驗，測得短刺小克銀漢霉對芍藥苷的轉化率為（43.00 ±2.73）%，芍藥內酯苷的產率為（9.29 ± 0.10）%。

3 結論

為了構建一套高效的基于短刺小克銀漢霉的芍藥苷轉化芍藥內酯苷的微生物轉化體系和工藝，考察了菌種、培養(yǎng)基、底物和轉化條件等 4 方面的影響因素，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了一套較為高效的轉化工藝條件。與基礎發(fā)酵條件下相比，在優(yōu)化體系和優(yōu)化的工藝條件下，芍藥苷的轉化率從（11.39 ± 0.38）% 提高至（43.00 ± 2.73）%，芍藥內酯苷的產率從（5.43 ± 0.12）% 提升至（9.29 ±0.10）%，轉化效果有了顯著提高。但是芍藥內酯苷的產率仍然較低，其中一個原因是在芍藥苷轉化為芍藥內酯苷的過程中，有其他物質的產生，芍藥內酯苷并非唯一轉化產物。要提高芍藥內酯苷的轉化產率還需進一步研究其中起轉化作用的關鍵酶，并通過分子生物學手段對其進行代謝調控，提高其表達量和轉化活性。

表2 正交試驗設計的優(yōu)化結果

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