補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸對超促排卵小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞Wnt通路的影響

楊麗蕓，程長云，劉昱材，賈蕊，張瑞娟，杜惠蘭

胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性是胚胎成功著床的關(guān)鍵因素。體外受精-胚胎移植（in vitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET）技術(shù)是治療不孕癥的主要手段，募集較多卵泡并通過促性腺激素的應(yīng)用可以獲得較多高質(zhì)量卵子[1]，但臨床妊娠率卻一直未能盡如人意，研究表明，控制性超促排卵中大量雌孕激素的應(yīng)用會影響子宮內(nèi)膜形態(tài)和容受性[2]，子宮內(nèi)膜容受性的損害所致的著床失敗占到 2/3，是導(dǎo)致 IVF-ET 失敗的主要原因之一[3]。經(jīng)典 Wnt 信號通路在雌性哺乳動物生殖系統(tǒng)發(fā)育中作用重要，研究表明，多種 Wnt 信號蛋白在雌孕激素調(diào)節(jié)下，可參與胚泡著床[4]。本課題前期研究表明，補(bǔ)腎法、疏肝法雖然對生殖功能的影響機(jī)制不同，但均能調(diào)節(jié)卵巢功能，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，增加子宮內(nèi)膜厚度，改善子宮內(nèi)膜容受性并提高臨床妊娠率[5-7]。因此，補(bǔ)腎法、疏肝法是否通過干預(yù)Wnt/β-catenin 通路相關(guān)因子影響胚胎著床？其機(jī)制有何差異值得探討。因此，本研究選取課題組經(jīng)驗方補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸分別作為補(bǔ)腎法和疏肝法的代表方劑，對比研究兩種方法對小鼠子宮內(nèi)膜Wnt 通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子 Wnt7a 和 β-catenin 的影響，以探討兩者作用機(jī)制的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級、健康、雌性昆明小鼠90 只，6 ～ 7 周齡，體重 28 ～ 32 g；健康雄性昆明小鼠 90 只，8 ～ 9 周齡；均購自河北實驗動物中心，動物合格證號：1612191。雌、雄分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)室溫度保持在（20 ± 1）℃，相對濕度約 50%，自動控制光照 12 h，黑暗 12 h。

1.1.2 藥物與試劑 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方包括熟地黃 20 g、當(dāng)歸 9 g、山藥 12 g、山茱萸 15 g、女貞子 9 g、枸杞子 12 g、紫河車 10 g、淫羊藿 10 g、菟絲子12 g、覆盆子 10 g、香附 6 g、白芍 9 g、肉蓯蓉10 g、丹參 10 g，均購自石家莊樂仁堂，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院中藥系制成口服液，高劑量含生藥 5.4 g/ml，低劑量含生藥 2.7 g/ml，分別相當(dāng)于臨床用藥量（0.81 g/ml）的 20 倍和 10 倍；逍遙丸由河南宛西制藥股份有限公司生產(chǎn)，將 200、100 粒逍遙丸分別溶于 125 ml 蒸餾水中制成混懸液，高劑量含生藥 0.6 g/ml，低劑量含生藥 0.3 g/ml，置 4 ℃ 冰箱中備用；孕馬血清（PMSG）購自上海市計劃生育科學(xué)研究所；人絨毛膜促性腺激素（HCG）購自麗珠制藥廠。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 將 90 只雌性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)化分為 6 組：補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組、控制性超促排卵組（COH）和空白對照組，每組 15 只。各組每日腹腔注射生理鹽水，連續(xù) 8 d，至第9 天早 9 時空白對照組腹腔注射生理鹽水，其余各組同時注射 PMSG 10 IU/只。48 h 后空白對照組腹腔注射生理鹽水，其余各組腹腔注射 HCG 10 IU/只。當(dāng)晚各組分別與雄鼠按 1:1 進(jìn)行合籠，次日晨 8 時檢查陰栓，觀察到陰栓者記為妊娠第1 天。于妊娠第1 ～4 天，補(bǔ)腎高、低劑量組分別給予補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方口服液（5.4 和 2.7 g/ml）；疏肝高、低劑量組分別給予逍遙丸混懸液（0.6 和 0.3 g/ml）；對照組和 COH組每天灌服生理鹽水。各組小鼠均以 1 ml/100 g 灌胃，連續(xù)給藥 4 d。

1.2.2 標(biāo)本采集 妊娠第4 天晚 10 點每組小鼠于尾靜脈注射 0.2 ml 體積分?jǐn)?shù) 0.5% 的伊文思藍(lán)，摘除眼球法取血 3 ml，（24 ± 2）℃ 靜置 2 h 后3000 r/min 離心 3 min，取血清置于 –20 ℃ 冰箱中保存。各組小鼠取血后脫頸椎處死。剖腹取子宮并分離，生理鹽水漂洗后，將每只小鼠的子宮左右角分開，一半子宮固定于體積分?jǐn)?shù)為 4% 的多聚甲醛溶液中，脫水并石蠟包埋，用于免疫組化檢測，另一半 –80 ℃ 保存，以備檢測 mRNA。

1.2.3 指標(biāo)檢測

1.2.3.1 子宮內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 選取各組小鼠胚泡著床部位子宮組織，制備 HE 切片，光鏡下觀察小鼠子宮內(nèi)膜組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3.2 RT-PCR 取 100 mg 組織按照試劑盒說明提取總 RNA，并進(jìn)行相關(guān)濃度及純度的測定定量；取總 RNA 2 μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；目標(biāo)基因 mRNA 拷貝數(shù)用 GAPDH作為內(nèi)參校正，引物序列及退火溫度分別為：β-catenin（438 bp）：上游引物：5' ATCTTAAGCCC TCGCTCGGT 3'，下游引物：5' TTGCTCTTGCGT GAAGGACT 3'，退火溫度 55 ℃；Wnt7a（283 bp）：上游引物：5' GAATGGCGTGTGTGTGATGG 3'，下游引物：5' CTGGTAACTGCTATGGCCCC 3'；GAPDH（615 bp）：上游引物：5' GACCACAGTCC ATGCCATCA 3'，下游引物：5' CCCTAGGCCCCT CCTGTTAT 3'。PCR 反應(yīng)體系振蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于 PCR 儀擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 變性 3 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min；然后取每個標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物 6 μl 于 1% 的含 GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以 DNA marker（DL2000）作為標(biāo)準(zhǔn)片段標(biāo)記，電泳之后于紫外透射儀觀察，照相后應(yīng)用 Quantity One 凝膠圖像分析軟件對目的電泳條帶進(jìn)行分析，并以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結(jié)果以兩者的積分吸光度的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS23.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用±s表示，若滿足正態(tài)性及方差齊性，多組間比較用單因素方差分析，否則用秩和檢驗；P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)變化

空白對照組腺體多，腺腔大而飽滿，間質(zhì)疏密均勻，血管豐富。COH 組可見腺體減少，腺腔小，間質(zhì)致密。經(jīng)補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸治療后，各高劑量組腺體增多，間質(zhì)疏密較均勻，血管較豐富；各低劑量組較 COH 組腺體數(shù)量增加，間質(zhì)略均勻，但整體狀況略遜于高劑量組（圖 1）。

2.2 各組小鼠子宮 Wnt7a 和 β-catenin mRNA 表達(dá)情況

與空白對照組比較，Wnt7a 和 β-catenin 基因在 COH 組表達(dá)降低（P＜ 0.05）；與 COH 組比較，補(bǔ)腎高劑量組和疏肝高劑量組表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），補(bǔ)腎低劑量組和疏肝低劑量組表達(dá)增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P〉 0.05）。補(bǔ)腎高劑量組與疏肝高劑量組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P〉0.05）（圖 2 和表 1）。

3 討論

圖1 各組小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)（A：空白對照組；B：COH 組；C：補(bǔ)腎低劑量組；D：補(bǔ)腎高劑量組；E：疏肝低劑量組；F：疏肝高劑量組）（× 400）Figure 1 Endometrial morphology of mice in each group (A: Blank control group; B: COH group; C: Bushen low dose group; D:Bushen high dose group; E: Shugan low dose group; F: Shugan high dose group) (× 400)

圖2 各組小鼠子宮 Wnt7a 和 β-catenin mRNA 表達(dá)情況Figure 2 Expression of Wnt7a and β-catenin mRNA in the mice womb in each group

表1 各組小鼠子宮 Wnt7a 和 β-catenin mRNA比較（± s ）Table 1 Relative level of Wnt7a and β-catenin mRNA in the mice womb (± s )

表1 各組小鼠子宮 Wnt7a 和 β-catenin mRNA比較（± s ）Table 1 Relative level of Wnt7a and β-catenin mRNA in the mice womb (± s )

注：與空白對照組比較，*P ＜ 0.05；與控制性超促排卵組比較，△P ＜ 0.05；與補(bǔ)腎低劑量組比較，#P ＜ 0.05；與補(bǔ)腎高劑量組比較，▲P ＜ 0.05；與疏肝低劑量組比較，□P ＜ 0.05；與疏肝高劑量組比較，▽P ＜ 0.05。Notes: Compared with the blank control, *P ＜ 0.05; compared with the COH, △P ＜ 0.05; compared with bushen low dose group, #P ＜ 0.05; compared with bushen high dose group, ▲P ＜ 0.05; compared with shugan low dose group, □P ＜ 0.05; compared with shugan high dose group, ▽P ＜ 0.05.

組別 Groups n Wnt7a mRNA β-catenin mRNA空白對照 Blank control 15 1.066 ± 0.007△□▽#▲ 0.788 ± 0.050△□▽#控制性超促排卵 COH 15 0.601 ± 0.079*▽▲ 0.466 ± 0.021*▽▲補(bǔ)腎低劑量 Bushen low dose 15 0.712 ± 0.080* 0.545 ± 0.041*▲補(bǔ)腎高劑量 Bushen high dose 15 0.814 ± 0.076*△□ 0.693 ± 0.082△#□疏肝低劑量 Shugan low dose 15 0.684 ± 0.058*▲▽ 0.520 ± 0.049*▲疏肝高劑量 Shugan high dose 15 0.816 ± 0.048*△□ 0.619 ± 0.072*△

子宮內(nèi)膜容受性受到眾多細(xì)胞因子、蛋白及基因的調(diào)控，而外源性促性腺激素的應(yīng)用可導(dǎo)致內(nèi)分泌激素分泌失衡，子宮內(nèi)膜血供狀態(tài)、厚度、細(xì)胞因子等多因素改變，最終導(dǎo)致妊娠失敗。Wnt 信號通路是生物體內(nèi)的一條最基本的、保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，受多種 Wnt 配體、卷曲蛋白（FZD）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）受體以及下游效應(yīng)因子調(diào)控，是調(diào)控細(xì)胞生長分化的關(guān)鍵途徑。經(jīng)典 Wnt 信號途徑（Wnt/β-catenin）與胚胎著床關(guān)系密切，Wnt 配體通過與 FZD 和 LRP 形成三聚體，而后將信號傳導(dǎo)給蓬亂蛋白，從而阻止糖原合酶激酶 3β 對 β-catenin 的磷酸化和降解，使其在胞質(zhì)中大量聚集，轉(zhuǎn)入核內(nèi)與 T 細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）結(jié)合激活靶物質(zhì)的表達(dá)。已有研究表明，經(jīng)典 Wnt 信號通路與子宮內(nèi)膜增殖、分化、蛻膜化及胚胎植入關(guān)系密切[8-9]，該信號通路的激活是胚胎著床過程中所必需的[10]。多種 Wnt信號蛋白在雌孕激素調(diào)節(jié)下，可參與子宮內(nèi)膜分化和胚胎著床[4]。Wnt7a 為 Wnt 配體之一，對小鼠子宮發(fā)育及腺體形成至關(guān)重要[11]，可調(diào)控子宮上皮細(xì)胞的發(fā)育和分化[12]。研究表明，小鼠子宮內(nèi)膜中Wnt7a mRNA 在妊娠 4 d 子宮腔上皮大量表達(dá)[13]，并且在動情周期中隨激素水平的變化而變化[14]；而Wnt7a 基因敲除小鼠表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜腺體缺乏及子宮平滑肌層排列紊亂，影響胚胎著床[15-16]，且間質(zhì)中 Hox10/11 基因表達(dá)缺失[11]，而 Hox10/11 基因在胚胎植入、間質(zhì)蛻膜化過程中有重要作用[17]。因此，Wnt7a 可能通過經(jīng)典 Wnt/β-catenin 參與建立子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與間質(zhì)間的信號聯(lián)系，并且在著床窗口期介導(dǎo)了胚胎植入過程[18]。β-catenin 是Wnt 信號通路核心分子，參與細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，是信號通路被激活的標(biāo)志性物質(zhì)。研究表明，β-catenin 的異常表達(dá)會影響子宮內(nèi)膜的蛻膜化，從而導(dǎo)致著床失敗[19]，而 Wnt7a 可通過上調(diào)子宮上皮細(xì)胞核內(nèi)的 β-catenin 水平，激活Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并激發(fā)胚胎植入的相關(guān)反應(yīng)，從而改善胚胎著床的成功率[20]。

近年，中藥在改善子宮內(nèi)膜容受性方面取得了較大的進(jìn)步[21-22]。補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方為本課題組臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗方，由養(yǎng)精種玉湯合五子衍宗丸化裁而成，方中熟地黃滋補(bǔ)肝腎，養(yǎng)血填精，為君藥；山茱萸、肉蓯蓉、山藥、女貞子、枸杞子助熟地黃補(bǔ)益真陰、滋腎添精，紫河車、覆盆子、淫羊藿、菟絲子助君藥補(bǔ)腎助陽，共為臣藥；當(dāng)歸、白芍、丹參三藥養(yǎng)血活血，滋陰柔肝，配以香附行氣開郁，助行血運(yùn)，共為佐藥；諸藥合用，共奏滋陰補(bǔ)腎，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，種子育胎之效，正如《傅青主女科》“精滿則子宮易于攝精，血足則子宮易于容物，皆有子之道也”的理論思想。逍遙丸作為疏肝法代表方劑，源于《太平惠民和劑局方》，方中柴胡疏肝調(diào)經(jīng)，當(dāng)歸、白芍可養(yǎng)血斂陰，茯苓、白術(shù)、甘草可化氣血以斂肝陰，諸藥合用，以調(diào)暢沖任，以達(dá)調(diào)經(jīng)種子之效。

本研究顯示，與 COH 組比較，各治療組子宮組織形態(tài)變化明顯，內(nèi)膜相對較厚，間質(zhì)疏松，腺體豐富；補(bǔ)腎高劑量組和疏肝高劑量組 Wnt7a 和β-catenin 表達(dá)較 COH 組明顯增加，而各低劑量組表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義，說明補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸可能是通過上調(diào)小鼠子宮 Wnt7a 表達(dá)，進(jìn)而提高β-catenin 表達(dá)水平，激活 Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，來改善子宮內(nèi)膜形態(tài)，調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚胎著床，并且存在劑量關(guān)聯(lián)性，高劑量效果更佳。而補(bǔ)腎高劑量組與疏肝高劑量之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義，提示補(bǔ)腎法和疏肝法在調(diào)控 Wnt7a 和β-catenin 表達(dá)方面無差異，兩法激活 Wnt 經(jīng)典通路的機(jī)制和作用途徑相似。本研究為臨床 IVF-ET過程中配合應(yīng)用補(bǔ)腎法和疏肝法提供了實驗基礎(chǔ)，有利于提高 IVF-ET 臨床妊娠率。

[1] Zeng FH, Lei XM. Application of gonadotrophin in controlled ovarian hyperstimulation. Reprod Contracept, 2010, 30(5):352-355. (in Chinese)曾凡慧, 雷小敏. 促性腺激素在超促排卵中的應(yīng)用. 生殖與避孕,2010, 30(5):352-355.

[2] Zapantis G, Szmyga MJ, Rybak EA, et al. Premature formation of nucleolar channel systems indicates advanced endometrial maturation following controlled ovarian hyperstimulation. Hum Reprod, 2013,28(12):3292-3300.

[3] Morelli M, Misaggi R, Di Cello A, et al. Tissue expression and serum levels of periostin during pregnancy: a new biomarker of embryo-endometrial cross talk at implantation. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2014, 175:140-144.

[4] Carson DD, Lagow E, Thathiah A, et al. Changes in gene expression during the early to mid-luteal(receptive phase) transition in human endometrium detected by high-density microarray screening. Mol Hum Reprod, 2002, 8(9):871-879.

[5] Chang XF, Du HL, Gao X, et al. Effect of bushen tiaojing recipe on growth differentiation factor-9 in tubal infertility patients undergoing in vitro fertiliza-embryo transfer. Chin J Integr Traditional West Med,2011, 31(6):780-783. (in Chinese)常秀峰, 杜惠蘭, 高星, 等. 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對輸卵管性不孕癥患者體外受精-胚胎移植超排卵周期GDF-9的影響. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011, 31(6):780-783.

[6] Yang LY, Du HL, Bai J, et al. Effect of xiaoyao pill on the expression of BMP-6 in mouse oocytes and the outcome of pregnancy. Lishizhen Med Mater Med Res, 2015, 26(2):285-287. (in Chinese)楊麗蕓, 杜惠蘭, 白靜, 等. 逍遙丸對小鼠卵母細(xì)胞BMP-6表達(dá)及妊娠結(jié)局的影響. 時珍國醫(yī)國藥, 2015, 26(2):285-287.

[7] Gao X, Du HL, Tian QH, et al. Effect of soothing liver and tonifying kidney method on tissue morphology and angiogenesis of endometrium in superovulation rats. J Traditional Chin Med, 2015,56(9):782-787. (in Chinese)高星, 杜惠蘭, 田茜華, 等. 補(bǔ)腎法、疏肝法對超促排卵大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)及血管生成的影響. 中醫(yī)雜志, 2015, 56(9):782-787.

[8] Sonderegger S, Pollheimer J, Kn?fler M. Wnt signalling in implantation, decidualisation and placental differentiation--review.Placenta, 2010, 31(10):839-847.

[9] van der Horst PH, Wang Y, van der Zee M, et al. Interaction between sex hormones and WNT/beta-catenin signal transduction in endometrial physiology and disease. Mol Cell Endocrinol, 2012, 358(2):176-184.

[10] Araki Y, Okamura S, Hussain SP, et al. Regulation of cyclooxygenase-2 expression by the wnt and ras pathways. Cancer Res, 2003, 63(3):728-734.

[11] Miller C, Pavlova A, Sassoon DA. Differential expression patterns of Wnt genes in themurine female reproductive tract during development and the estrous cycle. Mech Dev, 1998, 76(1):91-99.

[12] Mericskay M, Kitajewski J, Sassoon D. Wnt5a is required for proper epithelial-mesenchymal interactions in the uterus. Development, 2004,131(9):2061-2072.

[13] Hayashi K, Erikson DW, Tilford SA, et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biol Reprod, 2009, 80(5):989-1000.

[14] Katayama S, Ashizawa K, Fukuhara T, et al. Differential expression patterns of Wnt and beta-catenin/TCF target genes in the uterus of immature female rats exposed to 17alpha-ethynyl estradiol. Toxicol Sci, 2006, 91(2):419-443.

[15] Xie BG, Zhu WJ. Role of Wnt/β-catenin signaling pathway in embryo implantation and development. Reprod Contracept, 2013, 33(5):328-332. (in Chinese)謝寶國, 朱偉杰. Wnt/β-catenin信號通路在胚胎著床和發(fā)育中的作用. 生殖與避孕, 2013, 33(5):328-332.

[16] Kiewisz J, Kaczmarek MM, Andronowska A, et al. Gene expression of Wnts, β-catenin and E-cadherin during the periimplantation period of pregnancy in pigs-involvement of steroid hormones. Theriogenology,2011, 76(4):687-699.

[17] Taylor HS, Bagot C, Kardana A, et al. HOX gene expression is altered in the endometrium of women with endometriosis. Human Reprod,1999, 14(5):1328-1331.

[18] Lei W, Yang ZM. Molecular regulatory network in embryo implantation. Prog Physiol Sci, 2010, 41(6):417-422. (in Chinese)雷偉, 楊增明. 胚胎著床的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò). 生理科學(xué)進(jìn)展, 2010,41(6):417-422.

[19] Jeong JW, Lee HS, Franco HL, et al. beta-catenin mediates glandular formation and dysregulation of beta-catenin induces hyperplasia formation in the murine uterus. Oncogene, 2009, 28(1):31-40.

[20] Zhang Y, Peng S, Kuang H, et al. Expression and regulation of Dickkopf2 during periimplantation in mice. J Reprod Dev, 2009, 55(1):17-22.

[21] Gao X, Chang XF, Du HL, et al. Effect of soothing liver therapy on oocyte quality and growth differentiation factor-9 in patients undergoing in vitro fertilization and embryo transfer. J Tradit Chin Med, 2013, 33(5):597-602.

[22] Li XN, Li YX, Zhou JH. Effects of Bushen Zhuyun decoction on the reproductive capacity of mice: an experimental research. Chin J Integr Traditional West Med, 2013, 33(3):365-369.李小妮, 李雅璇, 周吉海, 等. 補(bǔ)腎助孕湯對小鼠生殖能力影響的實驗研究. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2013, 33(3):365-369.