波拉霉素發(fā)酵工藝的優(yōu)化

孫正陽，呂廣新，孟浩毅，趙晨，楊兆勇，陳靜

波拉霉素（圖 1）是吸水鏈霉菌 LP93（Streptomyces hygroscopicusLP93）發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)酸化、過濾，菌體用溶劑提取、層析等方法分離提取得到的具有很高抗真菌活性的多羥基內(nèi)酯類新抗生素[1]。該抗生素是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所首次發(fā)現(xiàn)的一種新結(jié)構(gòu)天然抗菌化合物，具有廣譜抗微生物活性，對酵母菌、絲狀真菌、原蟲、革蘭陽性細(xì)菌均有活性，是一類廣譜抗真菌抗生素[2]。另外，其產(chǎn)生菌原始菌株的生物學(xué)效價已穩(wěn)定達(dá)到 3000 μg/ml，具有較好的應(yīng)用價值。因此，建立波拉霉素商品化生產(chǎn)的小型中試發(fā)酵工藝對于其應(yīng)用技術(shù)的研究是十分關(guān)鍵的。

本研究通過對波拉霉素發(fā)酵培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以枯草芽孢桿菌為檢定菌株進(jìn)行波拉霉素發(fā)酵液活性測定，獲得最優(yōu)的發(fā)酵條件，以利于提高其生物學(xué)效價，為波拉霉素的應(yīng)用研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 波拉霉素結(jié)構(gòu)圖Figure 1 The structure of polaramycin

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 超凈工作臺購自蘇州匯通空調(diào)凈化工程有限公司；CR22GIII 型高速離心機(jī)購自日本 Hitachi 公司；高壓滅菌鍋購自日本 Hirayama公司；ZHWY-3212 自控?fù)u床、37 ℃ 和 28 ℃ 培養(yǎng)箱均購自上海智城分析儀器制造有限公司；電子天平購自梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.1.2 產(chǎn)生菌和培養(yǎng)基 波拉霉素產(chǎn)生菌、枯草芽孢桿菌 63501 由本實(shí)驗(yàn)室保存；斜面培養(yǎng)基：天門冬素 0.05%、K2HPO40.05%、葡萄糖 1%、瓊脂 1.2%；種子培養(yǎng)基：黃豆餅粉 2% ～ 4%、(NH4)2SO40.3%、CaCO30.15%、葡萄糖 2%；基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1（用于進(jìn)行氮源及輔助氮源的優(yōu)化）：葡萄糖 3.5%、KH2PO40.5%、CaCO30.3%；基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2（用于進(jìn)行碳源的優(yōu)化）：黃豆餅粉 3.0%、(NH4)2SO40.5%、KH2PO40.5%、CaCO30.3%；發(fā)酵培養(yǎng)基（用于進(jìn)行消泡劑添加及發(fā)酵中補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)）：黃豆餅粉 3.0%、葡萄糖 3.5%、(NH4)2SO40.5%、KH2PO40.5%、CaCO30.3%；檢定培養(yǎng)基 I（上層）：蛋白胨 0.5%、牛肉浸出粉 0.5%、NaCl 0.8%、Na2HPO40.2%、瓊脂 1%、pH 7.0；檢定培養(yǎng)基 II（下層）：蛋白胨 0.5%、牛肉浸出粉 0.5%、NaCl 0.8%、Na2HPO40.2%、瓊脂2%，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵方法 取新鮮波拉霉素產(chǎn)生菌斜面，采用挖塊法接種于裝有 50 ml 種子培養(yǎng)基的250 ml 三角瓶中，于 28 ℃、220 r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 48 h，再以體積分?jǐn)?shù) 10% 的接種量接入裝有50 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基的 500 ml 三角瓶中，于 25 ℃、220 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 波拉霉素活性測定

1.2.2.1 雙碟的制備 取直徑約 90 mm、高 16 ～17 mm 的平底雙碟，注入加熱融化的檢定培養(yǎng)基 II 20 ml，使其在碟底均勻攤布，放置水平臺上凝固，以此作為底層。另取檢定培養(yǎng)基 I 適量加熱融化后，放冷至 48 ～ 50 ℃，加入 1% 枯草芽孢桿菌菌懸液，充分搖勻后用滅菌大口吸管在每個雙碟中分別加入 5 ml，使其在底層上均勻攤布，作為菌層，放置水平臺上冷卻后備用。

1.2.2.2 波拉霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵液的活性測定 精密吸取波拉霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵液1 ml，加入 1 ml 乙酸乙酯，充分混勻，取乙酸乙酯提取液進(jìn)行測定。在每一個雙碟中以等距離均勻安置不銹鋼小管（內(nèi)徑 6.0 mm，高 10.0 mm，外徑 7.8 mm）6 個，加入 200 μl 各組乙酸乙酯提取液，置于 37 ℃ 培養(yǎng)18 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.3 氮源及輔助氮源對波拉霉素發(fā)酵的影響 以原發(fā)酵培養(yǎng)基中添加黃豆餅粉 3.0% 為對照，分別用黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5%、花生餅粉 3.0%、黃豆餅粉 3.0% + 玉米漿 1.0%、黃豆餅粉 3.0% + 酵母膏 0.5%、黃豆餅粉 3.0% + 精介蛋白胨 0.5%、魚粉 2.2% + (NH4)2SO40.5%、黃豆餅粉 3.0% + KNO30.5%、黃豆餅粉 3.0% +NH4NO30.2%、黃豆餅粉 3.0% + NH4Cl 0.5%、芝麻餅粉 3.0%、玉米漿 2.0% + (NH4)2SO40.5% 作為氮源及輔助氮源添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1 中，進(jìn)行菌株的發(fā)酵，分別于發(fā)酵 72 h 及 96 h 取樣，測定抑菌活性，確定最適氮源。

1.2.4 碳源對波拉霉素發(fā)酵的影響 以原發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖 3.5% 為對照，分別用淀粉3.5%、蔗糖 3.5%、乳糖 3.5%、果糖 3.5%、甘油3.5%、糊精 3.5%、豆油 3.5%、玉米粉 3.5%、淀粉 3.0% + 葡萄糖 0.5% 作為碳源添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2 中，進(jìn)行菌株的發(fā)酵，分別于發(fā)酵 72 h 及96 h 取樣，測定抑菌活性，確定最適碳源。

1.2.5 消泡劑對波拉霉素發(fā)酵的影響 以發(fā)酵過程不添加消泡劑為對照，分別用豆油（0.1%、0.3%、0.5%）、泡敵（0.01%、0.03%、0.05%）及豆油 + 泡敵（0.1% + 0.01%、0.3% + 0.03%、0.5% + 0.05%）作為消泡劑添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行菌株的發(fā)酵，分別于發(fā)酵 72 h 及 96 h 取樣，測定抑菌活性，確定消泡劑對波拉霉素發(fā)酵的影響。

1.2.6 波拉霉素發(fā)酵的補(bǔ)料實(shí)驗(yàn) 在波拉霉素發(fā)酵過程中分別在不同發(fā)酵時間補(bǔ)加不同的培養(yǎng)基成分，以發(fā)酵過程不進(jìn)行補(bǔ)料為對照，測定抑菌活性，確定波拉霉素中試發(fā)酵的最佳補(bǔ)料條件。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 次及以上的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。所有數(shù)據(jù)均采用 ANOVA 分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05 即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同氮源對波拉霉素發(fā)酵的影響

利用發(fā)酵液抑菌活性評價 12 種不同氮源及輔助氮源對波拉霉素發(fā)酵的影響。結(jié)果如圖 2 所示，發(fā)酵 72 h 時，以花生餅粉 3.0%、黃豆餅粉3.0% + 玉米漿 1.0%、黃豆餅粉 3.0% + NH4NO30.2% 作為氮源效果最佳。而當(dāng)發(fā)酵 96 h 時，以黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5%、黃豆餅粉 3.0% +NH4Cl 0.5%、芝麻餅粉 3.0%、花生餅粉 3.0%、黃豆餅粉 3.0% + 精介蛋白胨 0.5% 作為混合氮源添加時，波拉霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵液抑菌活性提高最為明顯。

2.2 不同碳源對波拉霉素發(fā)酵的影響

由 10 種不同碳源對波拉霉素發(fā)酵的影響結(jié)果（圖 3）可知，無論是 72 h 還是 96 h，波拉霉素發(fā)酵的碳源以果糖最佳，葡萄糖次之，豆油最差。

2.3 消泡劑對波拉霉素發(fā)酵的影響

結(jié)果如圖 4 所示，從發(fā)酵發(fā)展趨勢可以看出豆油和泡敵添加量為 0.5% 和 0.05% 時對波拉霉素發(fā)酵幾乎無影響。

在考慮以上因素進(jìn)行研究的同時，各組實(shí)驗(yàn)均分別在發(fā)酵 72 h 和 96 h時取樣，對不同發(fā)酵時間進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵 96 h 較 72 h 抑菌活性提高明顯，因此確定波拉霉素的最佳發(fā)酵時間為96 h。

圖2 不同氮源對波拉霉素發(fā)酵的影響Figure 2 The effect of different nitrogen sources on the fermentation of polaramycin

圖3 不同碳源對波拉霉素發(fā)酵的影響Figure 3 The effect of different carbon sources on the fermentation of polaramycin

圖4 消泡劑的添加對波拉霉素發(fā)酵的影響Figure 4 The effect of adding defoamer on the fermentation of polaramycin

圖5 補(bǔ)料方式對波拉霉素發(fā)酵的影響Figure 5 The effect of feeding method on the fermentation of polaramycin

2.4 波拉霉素發(fā)酵的補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對波拉霉素發(fā)酵過程中的補(bǔ)料方式進(jìn)行了探討，結(jié)果如圖 5 所示，波拉霉素在發(fā)酵 72 h 時補(bǔ)加 1% 葡萄糖和 0.5% 黃豆餅粉效果最佳。

3 討論

氮源在微生物發(fā)酵中起著重要作用，為微生物提供基本的營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子等重要物質(zhì)，不僅供應(yīng)菌體生長和維持生命活動，還和代謝產(chǎn)物的生物合成密切相關(guān)[3]。黃豆餅粉是初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一氮源，因此本研究對 12 種不同氮源及輔助氮源進(jìn)行考察，綜合考慮中試發(fā)酵成本、穩(wěn)定性及酸堿性等因素，最終以黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5% 作為培養(yǎng)基的最佳氮源。

碳源是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中最重要的能源物質(zhì)之一，它能夠?yàn)槲⑸锏纳L及抗生素的合成提供能量及碳元素，因此對于微生物的生長發(fā)育具有決定性的作用[4]。因此在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察10 種不同碳源對波拉霉素發(fā)酵的影響，綜合考慮中試發(fā)酵工藝，最終以原培養(yǎng)基中葡萄糖 3.5% 作為波拉霉素發(fā)酵的碳源。

在液體發(fā)酵過程中，由于通氣、攪拌、菌液黏稠度逐漸增大以及培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物積累等原因，發(fā)酵液會產(chǎn)生大量的泡沫[5]，泡沫嚴(yán)重時，極易造成發(fā)酵液漫罐、雜菌污染及代謝異常等不利影響[6]。然而，適當(dāng)?shù)呐菽纬蓪股匕l(fā)酵氧傳遞速率（OTR）的提高有顯著作用，因此篩選適合的消泡劑對泡沫適量控制是波拉霉素發(fā)酵過程中的重要環(huán)節(jié)之一[7]。通常消泡的方法包括物理方法（如機(jī)械攪拌、靜電消泡、冷凍法等）和化學(xué)方法[6]?；瘜W(xué)方法通過消泡劑的添加來減少或控制泡沫，經(jīng)濟(jì)方便且效果好，目前在液體發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用[8]?；瘜W(xué)消泡劑的添加對微生物菌體生長會產(chǎn)生一定影響，可能會降低或抑制發(fā)酵微生物的生長和產(chǎn)量[9]。因此本研究考察兩種不同消泡劑（豆油和泡敵）及不同添加濃度對波拉霉素發(fā)酵的影響，結(jié)果表明添加一定量的豆油和泡敵對波拉霉素發(fā)酵幾乎無影響。

補(bǔ)料培養(yǎng)作為一種介于連續(xù)培養(yǎng)和分批培養(yǎng)之間的發(fā)酵方式，是指在發(fā)酵過程中，連續(xù)或間歇補(bǔ)加一種或幾種培養(yǎng)基成分，但不同時取出發(fā)酵液的發(fā)酵方法[10]。其具有提高菌體對氧和營養(yǎng)成分的利用率、緩和培養(yǎng)基底物抑制等特點(diǎn)，從而更有利于目的產(chǎn)物的生成，達(dá)到較大幅度提高產(chǎn)量的目的，目前已被廣泛應(yīng)用到各種發(fā)酵初級和次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中[11-12]。因此本研究對波拉霉素發(fā)酵過程中的補(bǔ)料方式進(jìn)行了探討，確定了其最佳補(bǔ)料方式。

綜上所述，本研究通過對波拉霉素發(fā)酵培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以枯草芽孢桿菌為檢定菌株進(jìn)行活性測定，確定波拉霉素發(fā)酵最優(yōu)的氮源為黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5%、最佳碳源為葡萄糖 3.5%、發(fā)酵 72 h 時補(bǔ)加 1% 葡萄糖和 0.5%黃豆餅粉、最終發(fā)酵 96 h，且豆油和泡敵添加量為0.5% 和 0.05% 時對波拉霉素發(fā)酵無影響。本研究為波拉霉素中試發(fā)酵條件的確定提供了依據(jù)，進(jìn)而為其應(yīng)用研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

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