脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程相關(guān)性研究

黃立綱，劉煉華，劉航齊，賈玫

心血管疾病已經(jīng)成為全球全因死亡的首要病因，且呈逐年上漲的趨勢(shì)，動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是其病理基礎(chǔ)。Lp-PLA2 是近年來(lái)引起廣泛關(guān)注的磷脂酶超家族成員，與心血管疾病密切相關(guān)，被認(rèn)為是冠心病（coronary artery disease，CAD）獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子[1]，大量研究表明 Lp-PLA2 可促進(jìn) AS 發(fā)展，為診斷及預(yù)防心血管事件的發(fā)生提供了新的手段。

Kolodgie 等[2]在冠狀動(dòng)脈事件猝死患者尸檢解剖中發(fā)現(xiàn)，在壞死中心巨噬細(xì)胞易損和破裂斑塊的周?chē)?Lp-PLA2 高表達(dá)，損害較輕的脂質(zhì)池Lp-PLA2 水平較低，可見(jiàn)隨著斑塊的進(jìn)程，斑塊組織中 Lp-PLA2 表達(dá)逐漸升高。朱雁洲等[3]通過(guò)檢測(cè)急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者、穩(wěn)定型心絞痛患者和排除冠心病者的 Lp-PLA2 水平和血管內(nèi)超聲虛擬組織學(xué)（intravascular ultrasoundvirtual histology，IVUS-VH）冠狀動(dòng)脈斑塊特征也得出相似結(jié)論，可見(jiàn) Lp-PLA2 在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中的重要作用，且與斑塊的性質(zhì)相關(guān)。

載脂蛋白 E（apolipoprotein E，ApoE）是血漿脂蛋白的重要成分，對(duì)脂質(zhì)的運(yùn)輸和代謝發(fā)揮主要作用，在 AS 的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。ApoE 基因缺陷小鼠可自發(fā)形成 AS 病變，與在人體內(nèi)的發(fā)展過(guò)程極為相似[4]。利用該模型觀測(cè) AS進(jìn)展過(guò)程中各種炎癥因子的濃度變化及作用和Lp-PLA2 在組織中的分布變化，可為臨床早期 AS的預(yù)防、診斷及病情評(píng)估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 主要儀器 LST008 全自動(dòng)生化分析儀由日本 Hitachi 公司生產(chǎn)；伯樂(lè) 680 酶標(biāo)儀由美國(guó)Bio-Rad 公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要試劑 ApoE 基因敲除小鼠、高脂飼料由北京華阜康生物科技有限公司提供；TC 酶法檢測(cè)試劑盒、TG 酶法檢測(cè)試劑盒均由美國(guó) Beckman Coulter 公司提供；HCY 循環(huán)酶法檢測(cè)試劑盒由北京柏定生物工程有限公司提供；Lp-PLA2 活性測(cè)定試劑盒由德國(guó) DiaSys 公司提供；抗小鼠 CRP ELISA 方法試劑盒、抗小鼠 IL-6 ELISA 試劑盒由美國(guó) R&D 公司提供；兔抗小鼠 Lp-PLA2 單克隆抗體由美國(guó) Proteintech 公司提供；免疫組化二抗試劑盒由上?；蚩萍加邢薰咎峁簧窖蜓逶河杀本┧魅R寶科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)方案 參照文獻(xiàn)[4]，設(shè)計(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)方案。6 周齡 ApoE 基因缺陷小鼠（品系C57BL/6J）55 只，全部為雄性，飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)、免疫缺陷動(dòng)物專(zhuān)用飼養(yǎng)間。每籠 5 只小鼠，飼料、飲水供應(yīng)充足。隨機(jī)選取 45 只做實(shí)驗(yàn)組，飼以含脂肪21%、膽固醇 0.15%（以重量計(jì)）的高脂飼料（滅菌照射處理）；其余 10 只為對(duì)照組，飼以一般飼料，小鼠均為自由采食。

1.2.2 AS 的觀察 自第20 周（周齡）起，每隔2 周隨機(jī)選取 2 只實(shí)驗(yàn)組小鼠，面靜脈取血約1 ml 至 EP 管，隨后斷頸處死，解剖暴露心臟。磷酸鹽緩沖液（PBS）灌注洗去血管中的血細(xì)胞，隨后注入 4% 甲醛固定液，小心剝離主動(dòng)脈。進(jìn)行石蠟包埋，切片厚度為 4 μm，蘇木精伊紅（HE）染色，觀察主動(dòng)脈根部及主動(dòng)脈弓小彎處等好發(fā)部位AS 斑塊形成情況。在鏡下觀察到脂質(zhì)核形成時(shí)判定 AS 模型建立成功，自此每周選取 3 只實(shí)驗(yàn)組小鼠、每隔 3 周選取 3 只對(duì)照組小鼠，取血并斷頸處死取主動(dòng)脈，做石蠟包埋抗 Lp-PLA2 免疫組織化學(xué)（IHC）染色。實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠生理狀況，如有意外死亡小鼠盡快解剖分析其死亡原因與 AS 的關(guān)系。

1.2.3 血脂及炎癥因子水平分析 血標(biāo)本離心分離血清，膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、同型半胱氨酸（HCY）、Lp-PLA2 使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)?？剐∈?C 反應(yīng)蛋白（CRP）以及抗小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）使用酶標(biāo)儀檢測(cè)。分析各項(xiàng)標(biāo)志物隨 AS 進(jìn)程的變化趨勢(shì)并比較同一時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異。

1.2.4 IHC 染色 自第27 周起每周選取 3 只實(shí)驗(yàn)組小鼠、每隔 3 周選取 3 只對(duì)照組小鼠，取血并斷頸處死，取主動(dòng)脈，做石蠟切片兔抗小鼠Lp-PLA2 單克隆抗體免疫組化染色，3% 過(guò)氧化氫溶液阻斷內(nèi)生過(guò)氧化氫酶，5% ～ 10% 山羊血清封閉，抗體稀釋度為 1:50，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，鏡下觀察 Lp-PLA2 在血管組織中的分布，探究 AS 不同時(shí)期 Lp-PLA2 在組織中的作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用單樣本的 K-S 檢驗(yàn)分別進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性檢驗(yàn)的計(jì)量資料采用±s的形式進(jìn)行描述。組間資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，生物標(biāo)志物與 AS 的相關(guān)性采用多重線(xiàn)性回歸分析評(píng)價(jià)。所有檢驗(yàn)以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生物標(biāo)志物隨時(shí)間變化曲線(xiàn)圖采用 GraphPad Prism 5 軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 AS 模型的建立

實(shí)驗(yàn)組小鼠共 45 只，飼養(yǎng)第4 周、第14 周、第24 周各出現(xiàn) 1 只小鼠死亡，可見(jiàn)外傷，大中動(dòng)脈未見(jiàn)明顯栓塞；主動(dòng)脈 HE 染色鏡下可見(jiàn)血管內(nèi)皮下脂質(zhì)核初步形成（24 周），但未見(jiàn)明顯的纖維帽形成，由此判斷死亡原因可能由同籠斗毆造成，與 AS 無(wú)關(guān)。

利用實(shí)驗(yàn)組小鼠做 HE 主動(dòng)脈染色觀測(cè) AS斑塊形成情況。實(shí)驗(yàn)組小鼠在第20 周齡時(shí)觀測(cè)到血管內(nèi)皮組織下泡沫細(xì)胞形成；26 周齡時(shí)可見(jiàn)脂質(zhì)核形成，AS 模型建立成功[4]；30 周齡時(shí)白細(xì)胞繼續(xù)聚集、脂質(zhì)持續(xù)堆積、纖維帽形成；36 周齡時(shí)纖維帽明顯變薄。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)期 HE 染色鏡下觀察結(jié)果如圖 1。

2.2 血清學(xué)檢測(cè)

各項(xiàng)生物標(biāo)志物隨實(shí)驗(yàn)組小鼠周齡的變化如圖 2，可見(jiàn) Lp-PLA2 隨時(shí)間變化呈上升趨勢(shì)，其余生物標(biāo)志物隨時(shí)間變化趨勢(shì)不明顯。

2.2.1 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的比較 選取與對(duì)照組同期的 10 組實(shí)驗(yàn)組小鼠數(shù)據(jù)，比較兩組小鼠各生物標(biāo)志物的水平（表 1）。各項(xiàng)指標(biāo)均成正態(tài)分布，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組 Lp-PLA2 水平明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），而其余指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P〉 0.05），提示在各項(xiàng)生物標(biāo)志物中，Lp-PLA2 隨 AS 進(jìn)展變化更明顯。

2.2.2 回歸分析 簡(jiǎn)單線(xiàn)性回歸分析顯示Lp-PLA2 與周齡相關(guān)（P＜ 0.001），體重及其他生物標(biāo)志物與周齡不成線(xiàn)性關(guān)系（P〉 0.05）。Lp-PLA2的回歸方程為 Y = 99.763x + 313.155（r2= 0.937），與周齡即 AS 進(jìn)程相關(guān)性較好。以周齡為應(yīng)變量（Y），體重、CHO、TG、HCY、Lp-PLA2、CRP 以及 IL-6 為自變量（xi），用逐步法進(jìn)行多重線(xiàn)性回歸分析，剔除了體重、CHO、HCY、CRP 及 IL-6 等自變量，得出方程 Y = 0.011xLp-PLA2– 2.214xTG–2.147（r2= 0.989，P＜ 0.001），擬合程度較高，但共線(xiàn)性診斷結(jié)果顯示 Lp-PLA2 存在共線(xiàn)性，因此采用嶺回歸分析。取 k = 0.26 時(shí)的回歸系數(shù)，得出方程 Y = 0.767778xLp-PLA2+ 0.000594xTG（r2=0.89658）。

圖1 HE 染色鏡下實(shí)驗(yàn)組小鼠各時(shí)期 AS 斑塊形態(tài)（× 40）（A：20 周齡時(shí)為 AS 早期，可見(jiàn)白細(xì)胞進(jìn)入到血管內(nèi)皮下，形成泡沫細(xì)胞；B：26 周齡時(shí)血管皮下脂質(zhì)堆積，脂質(zhì)核初步形成；C：30 周齡時(shí)脂質(zhì)核擴(kuò)大、纖維帽形成；D：36 周齡時(shí)脂質(zhì)核進(jìn)一步擴(kuò)大，纖維帽明顯變薄，血管腔隙變?。〧igure 1 The atherosclerosis plaque morphology of experimental mice in different stages microscopically, HE staining (× 40) (A:20 week-phase, early atherosclerosis, the leukocyte enter the vascular endothelium, turn into foam cells; B: 26 week-phase, the accumulation of lipid under the vascular endothelium, the lipid nucleus was initially formed; C: 30 week-phase, the lipid nucleus expanded, the fiber cap formed; D: 36 week-phase, the lipid nucleus further expanded, the fiber cap turn thin, the vascular cavity is smaller)

圖2 實(shí)驗(yàn)組生物標(biāo)志物隨時(shí)間變化曲線(xiàn)圖Figure 2 The biomarkers of the experimental group changed over time

表1 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組各生物標(biāo)志物的比較（± s ）Table 1 Comparison of biomarkers in control group and experimental group (± s )

表1 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組各生物標(biāo)志物的比較（± s ）Table 1 Comparison of biomarkers in control group and experimental group (± s )

變量 Variable 對(duì)照組（n = 10） Control group (n = 10) 實(shí)驗(yàn)組（n = 10） Experimental group (n = 10) P 值 P value體重（g） Weight (g) 32.9 ± 2.2 40.1 ± 5.8 0.26 CHO（mmol/L） 13.95 ± 2.28 21.26 ± 2.53 0.665 TG（mmol/L） 1.355 ± 0.523 1.922 ± 0.845 0.151 HCY（μmol/L） 7.4 ± 1.2 7.1 ± 1.3 0.964 Lp-PLA2（U/L） 2193 ± 93 3895 ± 339 ＜ 0.05 CRP（μg/ml） 14.808 ± 2.431 15.298 ± 2.688 0.706 IL-6（pg/ml） 21.840 ± 22.917 64.345 ± 158.766 0.091

2.3 免疫組織化學(xué)染色

小鼠主動(dòng)脈做抗 Lp-PLA2 IHC 染色，抗體稀釋度為 1:50。實(shí)驗(yàn)組小鼠 20 周齡時(shí)為AS 早期，Lp-PLA2 少量分布在近血管內(nèi)皮的巨噬細(xì)胞核周（圖 3）。31 周齡時(shí)為 AS 中期，DAB 著色區(qū)域較 20 周齡時(shí)明顯擴(kuò)大，Lp-PLA2 主要分布在血管內(nèi)皮下的巨噬細(xì)胞及脂質(zhì)核中心（圖 4）。37 周齡時(shí)為 AS 中后期，Lp-PLA2 更多分布在變薄的纖維帽下（圖 5）。喂養(yǎng)一般飼料的對(duì)照組小鼠，其主動(dòng)脈 AS 斑塊內(nèi)抗 Lp-PLA2 的 DAB 著色明顯比實(shí)驗(yàn)組較淺（圖 6）。

圖3 AS 早期（20 周齡實(shí)驗(yàn)組小鼠），Lp-PLA2 隨與之結(jié)合的 LDL 進(jìn)入血管內(nèi)皮下，并分布在巨噬細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞間 DAB 著色較淺（× 100）Figure 3 In the early stage of atherosclerosis (20 week-phase of experimental mice), Lp-PLA2 was combined with the LDL into the endothelium and distributed in macrophages, with a relatively shallow DAB between cells (× 100)

圖4 AS 中期（31 周齡實(shí)驗(yàn)組小鼠）細(xì)胞間 DAB 著色加深，Lp-PLA2 主要分布在脂質(zhì)核中心（× 40）Figure 4 In the middle of atherosclerosis (31 week-phase of the experimental mice), DAB staining was enhanced, and Lp-PLA2 was mainly distributed in the lipid nucleus (× 40)

圖5 AS 中后期（37 周齡實(shí)驗(yàn)組小鼠），Lp-PLA2 主要分布在變薄的纖維帽下（× 40）Figure 5 In the middle and late stage of atherosclerosis(37 week-phase of experimental mice), Lp-PLA2 was mainly distributed under the thinning fiber cap (× 40)

圖6 AS 進(jìn)展中期（36 周齡對(duì)照組小鼠），纖維帽初步形成，DAB 著色較淺（× 40）Figure 6 In the middle stage of atherosclerosis (36 week-phase of control mice), the fiber cap was initially formed, and DAB was relatively light (× 40)

3 討論

多項(xiàng)研究證實(shí) ApoE 基因缺陷小鼠的 AS 病變發(fā)展同人類(lèi)極其相似，是適合用于研究人體 AS研究的動(dòng)物模型。Nakashima 等[5]利用高脂喂養(yǎng)的ApoE 基因缺陷小鼠在 5 ～ 6 周齡就被觀察到單核細(xì)胞趨附，8 ～ 10 周齡時(shí)主動(dòng)脈外觀可見(jiàn)脂紋形成，在 15 ～ 20 周齡時(shí)有纖維斑塊形成；Johnson 和Jackson[6]也利用其建立 AS 模型，飼養(yǎng)至斑塊破裂自然死亡，時(shí)長(zhǎng)為（46 ± 3）周，為 AS 模型建立提供了參考依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中的高脂喂養(yǎng) ApoE 基因敲除小鼠與上述模型相比病變發(fā)展較慢，是因?yàn)榈? 周齡起才開(kāi)始喂養(yǎng)高脂飲食（購(gòu)入時(shí) 6 周齡 +1 周適應(yīng)期，共 7 周喂養(yǎng)一般飼料），且高脂飼料的配方存在一定差異。

有些學(xué)者認(rèn)為 Lp-PLA2 在小鼠與人體內(nèi)結(jié)合的脂蛋白不同，因而在 AS 中發(fā)揮的作用亦不同[7-8]，但在本實(shí)驗(yàn)中，Lp-PLA2 在小鼠模型中依舊表現(xiàn)出了與 AS 較好的相關(guān)性。ApoE 基因敲除小鼠無(wú)論是否高脂喂養(yǎng)都會(huì)自發(fā)形成嚴(yán)重的高脂血癥和 AS 斑塊，因此本實(shí)驗(yàn)中的“周齡”可間接反映 AS 的進(jìn)展情況，而對(duì)照組可看作是 AS 進(jìn)展程度較低的小鼠。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠Lp-PLA2 顯著高于對(duì)照組，提示隨 AS 進(jìn)展Lp-PLA2 升高明顯，臨床監(jiān)測(cè)到此指標(biāo)的明顯升高可提示 AS 病變的生成。簡(jiǎn)單線(xiàn)性回歸分析顯示Lp-PLA2 與周齡呈顯著的線(xiàn)性相關(guān)，而其余指標(biāo)都不與周齡呈線(xiàn)性關(guān)系，提示 Lp-PLA2 與AS 的相關(guān)性要優(yōu)于其他指標(biāo)，臨床檢測(cè) Lp-PLA2 有助于對(duì)患者 AS 進(jìn)展情況的把握。

進(jìn)行多重線(xiàn)性回歸時(shí)體重、CHO、HCY、CRP及 IL-6 的P〉 0.05，回歸系數(shù)可能為零，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此僅以 Lp-PLA2 及 TG 為自變量得出方程。但 TG 回歸系數(shù)為負(fù)數(shù)，不符合臨床常理，共線(xiàn)性診斷顯示 Lp-PLA2 的方差膨脹因子（variance inflation factor，VIF）值大于 10，存在共線(xiàn)性，改做嶺回歸分析[9]。分析結(jié)果顯示 k 值在0.2 ～ 0.3 時(shí)，方程基本穩(wěn)定。自 k = 0.26 起，TG 的回歸系數(shù)大于 0 符合常理，取此時(shí)的回歸系數(shù)，得出方程 Y = 0.767778xLp-PLA2+ 0.000594xTG（r2=0.89658）。

可利用以周齡即 AS 進(jìn)程為 Y，Lp-PLA2 及TG 為 xi得出的方程準(zhǔn)確判斷 AS 病變的進(jìn)展時(shí)期，以本實(shí)驗(yàn)建模過(guò)程為例，通過(guò)測(cè)定小鼠Lp-PLA2 及 TG 值，利用方程 Y = 0.767778xLp-PLA2+ 0.000594xTG計(jì)算周齡，所得結(jié)果 ＜ 19 則小鼠主動(dòng)脈尚無(wú) AS 斑塊形成，20 ～ 26 則處于 AS 早期（脂質(zhì)核形成），27 ～ 32 為 AS 中期（脂質(zhì)核擴(kuò)大、纖維帽形成），33 ～ 37 為 AS 進(jìn)展中后期（脂質(zhì)核進(jìn)一步擴(kuò)大、纖維帽變薄，有斑塊破裂風(fēng)險(xiǎn)）。如果能夠觀測(cè)人體內(nèi)斑塊形成情況及相關(guān)標(biāo)志物水平，建立用于人體 AS 模型的方程 Y = b1x1+ b2x2+ b3x3+ … + bnxn+ bn+1探討其間關(guān)系，那么僅做血清學(xué)檢測(cè)就可利用模型推斷病情，大大簡(jiǎn)化臨床診斷 AS 的過(guò)程。根據(jù) Lp-PLA2 的生物學(xué)特性，以L(fǎng)p-PLA2 作為治療靶點(diǎn)，進(jìn)行相關(guān)藥物的研究也是今后研究的方向。

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