海洋鏈霉菌IMB3-202產(chǎn)生的吲哚咔唑生物堿

王冕，郝曉萌，李嬌，胡媛媛，關(guān)艷，王以光，甘茂羅，肖春玲

吲哚咔唑（indolocarbazole）生物堿是一類具有吲哚[2,3-α]-吡咯并[3,4-c]咔唑母核結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物，具有良好的抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒和神經(jīng)保護(hù)等生物活性[1-2]。該類化合物作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶以及與細(xì)胞周期有關(guān)的激酶，如酪氨酸蛋白激酶（PTKs）、蛋白激酶 A（PKA）、蛋白激酶 C（PKC）等多個(gè)作用靶點(diǎn)，其抗腫瘤活性引起廣泛的關(guān)注。自 1977 年第一個(gè)吲哚咔唑生物堿——星形孢菌素（staurosporine）發(fā)現(xiàn)以來，從多個(gè)屬的放線菌、黏細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌以及海洋無脊椎動(dòng)物中，分離得到 130 多個(gè)吲哚咔唑天然產(chǎn)物[2]。多個(gè)吲哚咔唑衍生物作為抗腫瘤藥物進(jìn)入臨床研究[2-3]。2017年 4 月，美國食品藥品管理局批準(zhǔn)了第一個(gè)吲哚咔唑類藥物——米哚妥林（midostaurin，PKC412）上市，用于治療 FLT3 突變陽性的急性骨髓性白血病[4]，表明該類化合物具有良好的臨床應(yīng)用開發(fā)前景。

在從海洋放線菌篩選新抗生素的過程中，我們對黃海分離的放線菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞活性篩選[5-8]。為了解菌株的次級(jí)代謝潛能，對部分陽性菌株進(jìn)行了基因組測序。利用 AntiSMASH 4.0對菌株基因組次級(jí)代謝基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)海洋鏈霉菌Streptomycessp. IMB3-202 基因組中一條基因簇與吲哚咔唑類化合物的生物合成基因非常相似，提示該菌株具有產(chǎn)生吲哚咔唑的次級(jí)代謝潛能。為獲得該類化合物，通過優(yōu)化發(fā)酵條件和系統(tǒng)分離純化，分離得到 4 個(gè)吲哚咔唑衍生物，包括星形孢菌素（1）[9-10]、3'-O-去甲基星形孢菌素（2）[11]、holyrine A（3）[12]和 K252c（4）[13]。本文主要介紹菌株的基因組序列分析、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及活性評價(jià)等結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 菌株 IMB3-202 分離自中國大連黃海黑石礁海灣（38°49'N，121°34'E）深度約為 40 m的海洋沉積物。通過 16S rRNA 基因（GenBank No. HM467146）序列 Blast 比對分析，該菌株與新霉素鏈霉菌 Streptomyces fradiae（GenBank AB184776）相似度達(dá) 98.17%，確定該菌株為鏈霉菌屬放線菌。菌株 IMB3-202 中的星形孢菌素生物合成基因簇部分序列數(shù)據(jù)提交 GenBank 保存（No.MG489830）。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（R-ISP4 培養(yǎng)基）：淀粉 10 g、磷酸二氫鉀 1 g、硫酸鎂 1 g、氯化鈉1 g、硫酸銨 2 g、碳酸鈣 2 g、麥麩 30 g、海鹽30 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基 1：酪蛋白胨 5 g、丙三醇 5 ml、酵母浸膏 1 g，ddH2O 至1 L，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基 2：蔗糖 40 g、NH4Cl 2 g、Na2SO42 g、K2HPO41 g、MgCl2·6H2O 1 g、NaCl 1 g、CaCO32 g、ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基 3：淀粉 10 g、酵母膏 4 g、蛋白胨 2 g、KBr 10 mg、FeSO4·7H2O 4 mg，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基 4：酵母膏 2 g、麥芽糖10 g、葡萄糖 4 g、ddH2O 至 1L，pH 7.0 ～ 7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基 5：胰蛋白胨 10 g、酵母膏 5 g、甘氨酸0.5 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基 6：淀粉 25 g、葡萄糖 5 g、蛋白胨 3 g、牛肉膏 3 g、CaCO32.5 g、FeSO41 mg、MnCl21 mg、ZnSO41 mg、CuSO41 mg、CoCl21 mg，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基 7：淀粉 10 g、葡萄糖 25 g、棉籽餅粉 10 g、蛋白胨 3 g、KH2PO40.1 g、MgSO40.1 g、NaCl 5 g、CaCO35 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基 8：胰蛋白胨 3 g、酪蛋白 4 g、葡萄糖 5 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。

1.1.3 儀器與試劑1H 和13C-NMR 譜用Bruker 600 MHz 核磁共振儀測定（溶劑峰為內(nèi)標(biāo)）；LC-MS 分析用安捷倫 LC-MSD-Trap/SL 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（1200 系列）；化合物 HPLC 制備用島津 LC-20AD 液相色譜儀（SPD-M20A 型紫外檢測器）。Amberlite XAD7HP 大孔樹脂為美國羅門哈斯公司產(chǎn)品；Sephadex LH-20 凝膠為美國 GE Biosciences 公司產(chǎn)品；Cosmosil C-18 色譜柱為日本 Nacalai 公司產(chǎn)品；薄層色譜硅膠購自青島海洋化工廠分廠；人工海鹽購自天津中鹽海洋生物公司?；蚪M掃描圖測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化與產(chǎn)物分析 將保存的菌株 IMB3-202 孢子懸液涂布于 R-ISP4 培養(yǎng)基，28 ℃ 靜置培養(yǎng) 10 d。將活化的菌株接種到每瓶含100 ml 的發(fā)酵培養(yǎng)基 1 ～ 8 的 500 ml 三角瓶中，每種培養(yǎng)基分別采用添加 3% 人工海鹽（1A ～ 8A）和不加海鹽（1B ～ 8B）兩種組成形式。于 28 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 5 d，獲得發(fā)酵培養(yǎng)物。發(fā)酵液離心獲得上清液，上清液上 XAD7HP 樹脂柱層析，分別用水和丙酮洗脫。收集丙酮洗脫餾分，減壓蒸餾后得到提取物浸膏，將浸膏溶解于 5 ml甲醇中，10 000 r/min 離心 10 min，取上清液 5 μl進(jìn)行 LC-MS 分析。色譜柱：Capcell MG II C18，3 μmol/L，3.0 mm × 150 mm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A 相為 5 mmol/L 醋酸銨水溶液，B 相為乙腈；梯度：0 ～ 30 min，10% ～ 90% B。流速：0.5 ml/min；檢測波長：280 nm。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化 將活化的 IMB3-202菌種接種于含 100 ml 7A 培養(yǎng)基的 500 ml 三角瓶中，28 ℃、200 r/min 振搖培養(yǎng) 120 h，獲得發(fā)酵培養(yǎng)物，共 25 L。將發(fā)酵培養(yǎng)物離心得到菌絲體與上清液兩部分。上清液經(jīng) XAD7HP 大孔樹脂柱色譜（5 L），依次用水、50%、100% 丙酮洗脫，收集 50% 和 100% 丙酮洗脫餾分，減壓濃縮得到相應(yīng)的提取物浸膏；菌絲體經(jīng)丙酮超聲提取 3 次，合并提取液，減壓濃縮得到菌絲體提取物?；钚詸z測表明，50%、100% 丙酮洗脫餾分和菌絲體提取物均具有抗菌活性。將上述活性部分合并，得到活性組分浸膏共 32.2 g。將該浸膏上硅膠柱層析（600 g），二氯甲烷-甲醇梯度（100:1、50:1、20:1、9:1、4:1、2:1、0:100，V/V）洗脫，經(jīng) TLC 板和活性檢測，合并相似餾分得到 7 個(gè)組分（F1～F7）。組分 F3（600 mg）經(jīng) Sephadex LH-20 柱色譜，二氯甲烷-甲醇 1:1 洗脫，得到 3 個(gè)混合組分（F3-1～ F3-3）。組分 F3-1（200 mg）經(jīng) HPLC 制備[25% 乙腈（含 0.1% 甲酸）溶液為流動(dòng)相，流速5 ml/min]純化得到化合物 1（100 mg）。組分 F3-2（50 mg）經(jīng) HPLC 半制備[30% 乙腈（含 0.1%甲酸）溶液為流動(dòng)相，流速 5 ml/min]純化得到化合物 3（3 mg）。F3-3（26 mg）經(jīng) HPLC 半制備[40%乙腈（含 0.1% 甲酸）溶液為流動(dòng)相，流速 5 ml/min]純化得到化合物 4（2 mg）。組分 F4（500 mg）經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，二氯甲烷-甲醇 1:1 洗脫得到 4 個(gè)混合組分（F4-1～ F4-4），組分 F4-3經(jīng) HPLC半制備[23% 乙腈（含 0.1% 甲酸）溶液為流動(dòng)相，流速 5 ml/min]純化得到化合物 2（2 mg）。

1.2.3 抗菌活性測定 活性檢定菌株包括銅綠假單胞菌（ATCC27853）、銅綠假單胞菌11（敏感株）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）、摩氏摩根菌（ATCC 25830）、摩氏摩根菌 KL-225（多重耐藥菌）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213）、金黃色葡萄球菌 R6101（甲氧西林耐藥）、枯草芽孢桿菌（ATCC6633）、白色念珠菌（ATCC93025）購自 ATCC 或臨床收集，由本課題組保存。活性跟蹤，以摩氏摩根菌作為檢定菌采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行[14]?；衔锏淖畹鸵种茲舛龋∕IC）采用文獻(xiàn)[15]報(bào)道的 96 孔板微量肉湯稀釋法進(jìn)行。

1.2.4 細(xì)胞毒活性測定 細(xì)胞毒活性采用 MTT比色法測定[16]。用胰酶消化對數(shù)生長期的細(xì)胞，以200 μl/孔、含 4000 個(gè)細(xì)胞的密度接種到 96 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后按照實(shí)驗(yàn)需要加入不同濃度的藥物，每個(gè)濃度設(shè)有 3 個(gè)平行復(fù)孔；藥物作用 48 h 后，每孔加入 20 μl 噻唑藍(lán)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h 后，吸出 96 孔板中所有液體，每孔加入 150 μl DMSO 溶液，置于水平搖床振蕩20 ～ 30 min，在酶標(biāo)儀 570 nm 下測定吸光度值（A）。細(xì)胞存活率 =（A加藥組–A空白組）/（A對照組–A空白組）× 100%。根據(jù)細(xì)胞成活率計(jì)算半數(shù)抑制濃度。空白組為無細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，對照組為無藥細(xì)胞組。

2 結(jié)果

2.1 基因組生物信息學(xué)分析

利用 Illumina Hiseq 4000 測序平臺(tái)獲得的菌株3-202 基因組掃描圖包含 630 個(gè)重疊群（contig），堿基總數(shù)為 6.4 Mb。利用 antiSMASH 3.0[17]對菌株 3-202 基因組進(jìn)行次級(jí)代謝生物合成基因分析，提示其基因組中包含 20 個(gè)次級(jí)代謝基因簇，可能的產(chǎn)物類型有鐵載體、非核糖體肽（NPRS）、萜、氨基糖苷、聚酮（PKS）、吲哚類等。其中位于重疊群 ctg75 中的基因簇clu7，與吲哚咔唑類化合物星形孢菌素（sta，GenBank No. AB088119）[18]、蝴蝶霉素（reb，AB071405）[19]、cladoniamide A（cla，JN165773）[20]、K252a（ink，DQ399653）[21]和reductasporine（red，KP274854）[22]等基因簇高度相似（圖 1）。生物信息學(xué)分析表明，基因簇clu7含有 13 個(gè)基因，其中orf3-5和orf8分別編碼L-氨基酸氧化酶、色吡咯酸合成酶、細(xì)胞色素 P450以及單氧化酶（表 1）。它們分別與來自鏈霉菌TP-A0274 的sta基因簇中的staO（蛋白一致性82%）、staD（蛋白一致性 72%）、staP（蛋白一致性 74%）、staC（蛋白一致性 79%）為同源基因，這些基因編碼蛋白負(fù)責(zé)吲哚[2,3-α]-吡咯并[3,4-c]咔唑母核結(jié)構(gòu)的合成[23]；基因orf6和orf7分別編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶和O-甲基轉(zhuǎn)移酶，與sta中的staMA和staMB為同源基因，分別催化星形孢菌素氨基糖單元（L-ristosamine）的 4'-NH2和 3-OH甲基化反應(yīng)[24]；orf1編碼細(xì)胞色素 P450，orf2 編碼 N-糖基轉(zhuǎn)移酶，這兩個(gè)基因與sta中催化吲哚咔唑母核與糖基偶聯(lián)反應(yīng)的兩個(gè)蛋白 StaN 和StaG 具有較高的同源性（85% 和 78%）。此外，clu7中還含有轉(zhuǎn)運(yùn)及耐藥等相關(guān)基因（orf10、11、13）。從圖 1 所示吲哚咔唑類化合物的基因簇可知，cladoniamide A 基因簇cla中同時(shí)含有O-甲基和N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（claM1 和claM3），但缺少糖基合成及連接相關(guān)基因；蝴蝶霉素（reb）和K252a（ink）基因簇中僅含有O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（rebM和inkM），reductasporine 基因簇（red）中不存在甲基轉(zhuǎn)移酶基因；只有sta中同時(shí)包含母核合成、糖基合成與連接、O-甲基、N-甲基轉(zhuǎn)移酶等基因。因此，clu7的基因組成與sta相似度最高。根據(jù)以上分析，推測菌株 3-202 中clu7的產(chǎn)物可能是星形孢菌素類化合物。

圖1 clu7 與其他吲哚咔唑類化合物生物合成基因簇的比較Figure 1 Comparison of clu7 and indolocarbazole biosynthetic gene clusters

表1 海洋鏈霉菌 IMB3-202 clu7 中各片段的功能預(yù)測Table 1 Deduced functions of ORFs in clu7 in Streptomyces sp. IMB 3-202

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物分析

為獲得基因簇clu7的表達(dá)產(chǎn)物，我們采用8 種發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加 3% 人工海鹽（1A ～8A）和不加海鹽（1B ～ 8B），對菌株 IMB3-202 進(jìn)行發(fā)酵。利用多重耐藥摩氏摩根菌 KL-225 對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抗陰性菌活性測定，結(jié)果顯示 5A、5B、6A、6B 和 7A 發(fā)酵液顯示出顯著的抗菌活性（抑菌圈 15 ～ 17 mm）。對 7A 培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的 LC-MS 分析（圖 2），部分發(fā)酵產(chǎn)物中有一些組分顯示出吲哚咔唑類的特征紫外光譜，質(zhì)譜顯示出m/z467 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子，提示代謝產(chǎn)物中含有星形孢菌素類化合物[25]。其中，以 7A發(fā)酵液中星形孢菌素類成分含量較高，且產(chǎn)物多樣性較豐富。因此，選用 7A 培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行大量發(fā)酵和分離純化。

2.3 結(jié)構(gòu)解析

化合物 1（圖 3）為淺黃色粉末，電噴霧質(zhì)譜（ESIMS）顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z467 [M+H]+，結(jié)合 NMR 數(shù)據(jù)推測其分子式為 C28H26N4O3?；衔?1 的紫外（UV）光譜在 244、292、334、354、371 nm 顯示出最大吸收峰；1H-NMR 在低場區(qū)顯示出 2 組 1,2-二取代芳香質(zhì)子信號(hào)，1 個(gè)糖端基質(zhì)子；高場區(qū)顯示出 2 個(gè)連氧或連氮次甲基質(zhì)子，4 個(gè)亞甲基質(zhì)子以及 3 個(gè)甲基質(zhì)子。13C-NMR 譜顯示出 28 個(gè)碳信號(hào)，DEPT 譜表明這些碳信號(hào)分別為 3 個(gè)甲基碳（包括 1 個(gè)甲氧基δC60.0 和1 個(gè)氮甲基δC32.1），2 個(gè)亞甲基碳，11 個(gè)次甲基（包括 8 個(gè) sp2雜化碳，3 個(gè)連氧或氮取代 sp3雜化碳），12 個(gè)季碳（包括 1 個(gè)羰基碳，10 個(gè)芳香碳和 1 個(gè) sp3雜化碳）。以上數(shù)據(jù)表明，化合物 1 具有吲哚咔唑類化合物的典型 NMR 數(shù)據(jù)特征[10]。通過與文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)比對，確定化合物 1 的結(jié)構(gòu)為星形孢菌素。

圖2 菌株 IMB3-202 在 7A 培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物 LC-MS 紫外 280 nm 色譜圖（A）和總離子流圖（B）Figure 2 LC-MS profile at 280 nm (A) and MS total ion current (B) of the extracts from Streptomyces sp. IMB3-202 cultured in 7A medium

圖3 化合物 1 ～ 4 的結(jié)構(gòu)Figure 3 The structures of compounds 1 - 4

化合物 2（圖 3）的分子式依據(jù) ESIMS 和NMR 數(shù)據(jù)確定為 C27H24N4O3。化合物 2 的 NMR數(shù)據(jù)比化合物 1 少 1 個(gè)甲氧基信號(hào)。此外，C-3'向高場位移 –9.2 ppm，H-3' 向低場位移 0.55 ppm，提示化合物 2 為 1 的 3'-O-去甲基衍生物，結(jié)構(gòu)確定為 3'-O-去甲基星形孢菌素[11]?；衔?3（圖 3）的分子式確定為 C26H24N4O3，不飽和度為 17，比化合物 1 的不飽和度少 1 個(gè)。與化合物 1 比較，化合物 3 的 NMR 數(shù)據(jù)中缺失了氮甲基與甲氧基的信息，提示化合物 3 為星形孢菌素的 3'-O-去甲基-4'-N-去甲基衍生物。此外，化合物 3 中 C-2' 為次甲基信號(hào)（δH4.70，q；δC78.4），并且 C-2' 的化學(xué)位移較化合物 2 中向高場位移 –15.5 ppm，說明化合物 3 中 C-2' 與 N-13 之間的 C-N 鍵發(fā)生斷裂。通過與文獻(xiàn)[12]數(shù)據(jù)比較，3 的波譜數(shù)據(jù)與 holyrine A 一致，因此化合物 3 的結(jié)構(gòu)確定為holyrine A?；衔?4（圖 3）的 MS、NMR 波譜顯示其糖單元部分的信號(hào)缺失，其結(jié)構(gòu)確定為星形孢菌素的苷元 K252c[13]。

星形孢菌素（1）：淡黃色粉末狀；UV（MeOH，HPLC）λmax244、292、334、354、371 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）、13C-NMR（CD3OD，150 MHz）數(shù)據(jù)見表 2；ESIMSm/z：467[M+H]+，933[2M+H]+。

3'-O-去甲基星形孢菌素（2）：淡黃色粉末狀；UV（MeOH，HPLC）λmax241、289、334、363 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）、13C-NMR（CD3OD，150 MHz）數(shù)據(jù)見表 2；ESIMSm/z：453[M+H]+。

Holyrine A（3）：淡黃色粉末狀；UV（MeOH，HPLC）λmax240、288、333、360 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）、13C-NMR（CD3OD，150 MHz）數(shù)據(jù)見表 2；ESIMSm/z：441[M+H]+。

K252c（4）：淡黃色粉末狀；UV（MeOH，HPLC）λmax240、288、333、360 nm；1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）、13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）數(shù)據(jù)見表 2；ESIMSm/z：312[M+H]+。

2.4 生物活性

對化合物進(jìn)行體外抗菌活性評價(jià)，結(jié)果表明，化合物 1 對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以及白色念珠菌具有較弱的抗菌活性，最低抑菌濃度（MIC）值為 128 μg/ml；對銅綠假單胞菌ATCC27853、摩氏摩根菌、肺炎克雷伯桿菌、大腸桿菌等沒有明顯的抑制活性，MIC 值 〉 256 μg/ml。

體外細(xì)胞毒活性結(jié)果（表 3）顯示，其中用阿霉素作陽性對照，陰性對照未加化合物?；衔?1和 2 對宮頸癌 HeLa 細(xì)胞和結(jié)腸癌 HCT116 細(xì)胞均具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50值均在納摩爾水平（0.75 ～ 12.3 nmol/L），對乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞的抑制活性較低，IC50約為 335 nmol/L?；衔?3對以上三種腫瘤細(xì)胞的抑制活性比 1 和 2 低約2 倍，表明 N12-C2' 鍵開環(huán)導(dǎo)致活性降低?；衔? 對以上腫瘤細(xì)胞的抑制活性比化合物 1 和 2低 25 ～ 2500 倍，表明糖基對吲哚咔唑類化合物的細(xì)胞毒活性具有重要的影響。

表2 化合物 1 ～ 4 的 NMR 數(shù)據(jù)*Table 2 The NMR spcetroscopic data for compounds 1 - 4*

表3 化合物 1 ～ 4 的體外細(xì)胞毒活性（IC50，nmol/L）Table 3 In vitro cytotoxic activity of compounds 1 - 4(IC50, nmol/L)

3 討論

本研究通過基因組生物信息學(xué)分析，在菌株IMB3-202 基因組中發(fā)現(xiàn)一條吲哚咔唑生物合成基因簇，進(jìn)而通過發(fā)酵條件優(yōu)化，最終從中分離并鑒定了 4 個(gè)吲哚咔唑類化合物。本研究結(jié)果表明，通過基因組學(xué)分析，可以在基因水平上預(yù)測產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，有助于快速識(shí)別特定類型的產(chǎn)物，對于微生物天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)具有重要的指導(dǎo)意義。

[1] Nakano H, Omura S. Chemical biology of natural indolocarbazole products: 30 years since the discovery of staurosporine. J Antibiot(Tokyo), 2009, 62(1):17-26.

[2] Sánchez C, Méndez C, Salas JA. Indolocarbazole natural products:occurrence, biosynthesis, and biological activity. Nat Prod Rep, 2006,23(6):1007-1045.

[3] Shaaban KA, Elshahawi SI, Wang X, et al. Cytotoxic Indolocarbazoles from Actinomadura melliaura ATCC 39691. J Nat Prod, 2015, 78(7):1723-1729.

[4] Kim ES. Midostaurin: first global approval. Drugs, 2017, 77(11):1251-1259.

[5] Wang Q, Zhang Y, Wang M, et al. Neo-actinomycins A and B, natural actinomycins bearing the 5H-oxazolo[4,5-b]phenoxazine chromophore, from the marine-derived Streptomyces sp. IMB094. Sci Rep, 2017, 7 (1):3591.

[6] Tan Y, Hu Y, Wang Q, et al. Tetrocarcins N and O, glycosidic spirotetronates from a marine-derived Micromonospora sp. identified by PCR-based screening. RSC Adv, 2016, 6(94):91773-91778.

[7] Gan M, Liu B, Tan Y, et al. Saccharothrixones A-D,tetracenomycin-type polyketides from the marine-derived actinomycete Saccharothrix sp. 10-10. J Nat Prod, 2015, 78(9):2260- 2265.

[8] Wu C, Tan Y, Gan M, et al. Identification of elaiophylin derivatives from the marine-derived actinomycete Streptomyces sp. 7-145 Using PCR-Based Screening. J Nat Prod, 2013, 76(11):2153-2157.

[9] Schupp P, Eder C, Proksch P, et al. Staurosporine derivatives from the ascidian eudistoma toealensis and its predatory flatworm pseudoceros sp. J Nat Prod, 1999, 62(7):959-962.

[10] Meksuriyen D, Cordell GA. Biosynthesis of staurosporine, 1. 1H- and 13C-NMR assignments. J Nat Prod, 1988, 51(5):884-892.

[11] Hoehn P, Ghisalba O, Moerker T, et al. 3'-Demethoxy-3'-hydroxystaurosporine, a novel staurosporine analogue produced by a blocked mutant. J Antibiot (Tokyo), 1995, 48(4):300-305.

[12] Williams DE, Bernan VS, Ritacco FV, et al. Holyrines A and B,possible intermediates in staurosporine biosynthesis produced in culture by a marine actinomycete obtained from the North Atlantic Ocean. Tetrahedron Lett, 1999, 40(40):7171-7174.

[13] Yasuzawa T, Iida T, Yoshida M, et al. The structures of the novel protein kinase C inhibitors K-252a, b, c and d. J Antibiot (Tokyo),1986, 39(8):1072-1078.

[14] Kreitlow S, Mundt S, Lindequist U. Cyanobacteria--a potential source of new biologically active substances. J Biotechnol, 1999, 70(1-3):61-63.

[15] Koeth LM, DiFranco-Fisher JM, McCurdy S. A reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically. J Vis Exp, 2015, 103:e53028.

[16] Gan M, Zheng X, Gan L, et al. Streptothricin derivatives from Streptomyces sp. I08A 1776. J Nat Prod, 2011, 74(5):1142-1147.

[17] Weber T, Blin K, Duddela S, et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Res, 2015, 43(W1):W237-W243.

[18] Onaka H, Taniguchi S, Igarashi Y, et al. Cloning of the staurosporine biosynthetic gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0274 and its heterologous expression in Streptomyces lividans. J Antibiot (Tokyo),2002, 55(12):1063-1071.

[19] Sánchez C, Butovich IA, Bra?a AF, et al. The biosynthetic gene cluster for the antitumor rebeccamycin: characterization and generation of indolocarbazole derivatives. Chem Biol, 2002, 9(4):519-531.

[20] Ryan KS. Biosynthetic gene cluster for the cladoniamides, bis-indoles with a rearranged scaffold. PLoS One, 2011, 6(8):e23694.

[21] Kim SY, Park JS, Chae CS, et al. Genetic organization of the biosynthetic gene cluster for the indolocarbazole K-252a in Nonomuraea longicatena JCM 11136. Appl Microbiol Biotechnol,2007, 75(5):1119-1126.

[22] Chang FY, Ternei MA, Calle PY, et al. Targeted metagenomics:finding rare tryptophan dimer natural products in the environment.J Am Chem Soc, 2015, 137(18):6044-6052.

[23] Groom K, Bhattacharya A, Zechel DL. Rebeccamycin and staurosporine biosynthesis: insight into the mechanisms of the flavin-dependent monooxygenases RebC and StaC. Chembiochem,2011, 12(3):396-400.

[24] Salas AP, Zhu L, Sánchez C, et al. Deciphering the late steps in the biosynthesis of the anti-tumour indolocarbazole staurosporine: sugar donor substrate flexibility of the StaG glycosyltransferase. Mol Microbiol, 2005, 58(1):17-27.

[25] Omura S, Iwai Y, Hirano A, et al. A new alkaloid AM-2282 of Streptomyces origin. Taxonomy, fermentation, isolation and preliminary characterization. J Antibiot (Tokyo), 1977, 30(4):275-282.