新型脫細胞動脈基質(zhì)的制備及理化性能評估

張增增，郝春香，郭維民，陳明學，王振勇，張學亮，李旭，荊曉光，劉雪劍，孫百川，郝立波，眭翔，劉舒云，郭全義，周成福

半月板是脛股關(guān)節(jié)的必要組成部分。由于半月板自身結(jié)構(gòu)的特異性，損傷后難以再生，尤其是內(nèi)側(cè)白白區(qū)[1]。目前可吸收的生物來源支架已經(jīng)被廣泛用于半月板的修復(fù)和再生，如美國的膠原半月板假體[2]。I 型膠原是半月板的主要基質(zhì)成分，因此，我們探索用 I 型膠原蛋白組成的血管組織制備組織工程半月板支架的可行性。傳統(tǒng)的脫細胞方法有物理程序法、化學洗滌劑法和酶消化法[3]。這些方法單一的運用，難以達到預(yù)期的抗原去除效果。本文采用三聯(lián)抗原去除程序制備脫細胞血管基質(zhì)，并對比分析其與半月板在結(jié)構(gòu)和成分上的差異，是國內(nèi)首次探討脫細胞血管基質(zhì)支架作為組織工程半月板支架的可行性實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料及試劑 新鮮牛大動脈購自北京市屠宰場，共 10 個牛心管；3 月齡的健康新西蘭白兔 10 只，由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供。所有動物實驗方案均經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準。十二烷基硫酸鹽（SDS）購自北京化學試劑公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自北京科昊達生物公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）和 DNase 酶為美國 Sigma 產(chǎn)品；RNase 酶購自美國 Thermo公司；羥脯氨酸定量試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.1.2 主要儀器 THZ-95 型臺式恒溫振蕩培養(yǎng)箱購自北京四環(huán)科學儀器廠；80 ℃ 深低溫冰箱為日本 Sanyo 公司產(chǎn)品；JSM-6700F 型掃描電鏡為日本 JEOL 公司產(chǎn)品；BB5060 型 CO2培養(yǎng)箱為德國 Heraeus 公司產(chǎn)品；冰凍切片機為日本 Leica公司產(chǎn)品；BH-2 型倒置顯微鏡、IX 70 型熒光顯微鏡、多功能顯微鏡均為日本 Olympus 公司產(chǎn)品；生物力學試驗機為美國 Bose 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 脫細胞血管基質(zhì)的制備 新鮮獲取的牛大動脈，剪裁成 4 mm × 8 mm × 2 mm 的片狀，置于無菌的容器內(nèi)，3% 的雙氧水漂洗 3 次，每次 0.5 h。將雙氧水倒盡，以無菌 PBS（pH 7.2 ～ 7.4）清洗3 次，每次 10 min。將血管置于三蒸水（低滲溶液）中進行 –80 ℃ 冷凍 2 h，然后 37 ℃ 水浴復(fù)溫 15 min，無菌三蒸水清洗 3 次，如此進行反復(fù)凍融 3 次后，在無菌操作臺用無菌眼科鉆切割成兔子半月板大小，置于 2% SDS（內(nèi)含蛋白酶抑制劑）溶液中，放入 37 ℃ 恒溫搖床中以 120 r/min旋轉(zhuǎn) 48 h（中間換一次液），將液體倒盡后，用無菌 PBS 液清洗至無明顯泡沫，加入一定 PBS 后放入搖床中，每 2 小時換液一次，持續(xù) 4 d 后，將液體倒掉，再用 PBS 清洗 3 次，每次 10 min，pH 值調(diào)整至 7.2 ～ 7.4，再將支架放入無菌的DNase 和 RNase 混合液中進行處理，24 h 換一次液，48 h 后將液體倒盡，用無菌 PBS 液體清洗3 次，每次 10 min。再將支架中的水分吸干，無菌袋分裝后，進行輻射劑量為 25 kGy 的60Co 射線輻照滅菌 6 ～ 9 h，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 組織學染色 用石蠟切片機將半月板支架切成 5 μm 的厚度。

⑴HE 染色：脫蠟后切片控水，蘇木素染色3 min，控水 2 min，分化 15 s，返藍1 min，控水2 min，80% 乙醇脫水，0.5% 伊紅染液浸染 45 s，逐級脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

⑵甲苯胺藍染色（1% 硼酸鹽法）：脫蠟后，控水 2 min，置入甲苯胺藍染液中浸染 30 min，控水2 min，濾紙吸干水分，丙酮分化 1 min，二甲苯透明，中性樹膠封固。

⑶天狼猩紅染色：脫蠟后切片控水，置入苦味酸天狼猩紅染液中浸染 30 min，自來水洗 2 min，逐級脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

⑷Hoechst33258 染色：脫蠟后，控水 2 min，然后滴加新配置好的 Hoechst33258 熒光染液避光染色 5 min，控水 1 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明，水性封片劑封片。

1.2.3 材料細胞毒性檢測（MTT） 支架材料按GB/T16812-2000 方法，厚度 ≥ 1.0 mm，按浸提液比例 1.25 cm2/ml，37 ℃ 下，在含 15% FBS 的DMEM 中浸泡 24 h。根據(jù)脫細胞程序中 SDS 處理后清洗的天數(shù)不同，分成 3 組，分別是清洗 1、2 和 4 d 組，每組 5 個樣品。以各組浸提液培養(yǎng)細胞，用酶標儀檢測OD值，觀察細胞活性。

1.2.4 掃描電鏡觀察 PBS 稀釋戊二醛至 2.5%（V/V），固定樣品 2.5 h 以上，將固定后的樣品放至不同濃度的酒精浸泡15 min，最后放在通風處將樣品晾干，鍍膜，噴金，粘托，掃描電鏡下觀察。

1.2.5 拉伸力學測試 將支架按纖維走向制備成7 cm × 7 mm × 2 mm 的長方體，按纖維走行分為4 組，分別是環(huán)向脫細胞前、環(huán)向脫細胞后、縱向脫細胞前、縱向脫細胞后，每組 3 個樣品。將各組樣品用 PBS 緩沖液浸潤，在實驗前用濾紙吸干，生物力學試驗機進行拉伸力學測試，利用 Origin 9.0 軟件求得應(yīng)力-應(yīng)變曲線，獲得彈性模量。

1.2.6 膠原含量測定 羥脯氨酸在膠原蛋白中含量最多，且是構(gòu)成結(jié)締組織中膠原纖維的主要成分，因此，羥脯氨酸的含量能夠反映膠原的含量。具體實驗步驟依據(jù)羥脯氨酸測試盒說明進行。

1.2.7 兔半月板細胞復(fù)合脫細胞血管基質(zhì) 取3 個月齡的新西蘭大白兔內(nèi)側(cè)半月板細胞，分離培養(yǎng)及傳代。將 P2代半月板細胞制備成 4 × 104個/ml細胞懸液，接種到脫細胞血管基質(zhì)中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 d 后進行掃描電鏡觀察，考察半月板細胞與脫細胞血管基質(zhì)的相容性。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS22.0 分析軟件對數(shù)值進行單因素方差分析，計量資料以±s表示，P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 脫細胞血管基質(zhì)與半月板掃描電鏡

掃描電鏡下，可見脫細胞血管基質(zhì)內(nèi)表面纖維（圖 1C）呈不規(guī)則網(wǎng)狀排列，與正常半月板超表面纖維（圖 1A）取向一致；血管基質(zhì)環(huán)切后的截面纖維走向（圖 1D）呈規(guī)則的橫行，并存在一定的間隙，與正常半月板大而厚的 C 形彎曲的主體纖維（圖 1B）存在高度的相似。

2.2 半月板、正常血管和脫細胞血管基質(zhì)組織化學成分比較

圖1 正常半月板掃描電鏡[4]和脫細胞血管基質(zhì)掃描電鏡觀察（A：正常半月板超表面纖維；B：正常半月板主體纖維；C：脫細胞血管基質(zhì)內(nèi)表面纖維；D：脫細胞血管基質(zhì)側(cè)面觀纖維）Figure 1 Scanning electron microscopy of normal meniscus[4] and acellular veins (A: Normal meniscus superficial fibers; B:Normal meniscus main fibers; C: Inner surface fibers of acellular vascular matrix; D: Fibers of acellular vascular in side view)

圖2 半月板和脫細胞前后血管切片 HE 染色（A：正常半月板；B：正常血管；C：脫細胞血管）Figure 2 HE staining of the meniscus, normal aorta and acellular aorta (A: Normal meniscus; B: Normal aorta; C: Acellular aorta)

圖3 半月板和脫細胞前后血管切片甲苯胺藍染色（A：正常半月板；B：正常血管；C：脫細胞血管）Figure 3 Toluidine blue staining of the meniscus, normal aorta and acellular aorta (A: Normal meniscus; B: Normal aorta; C:Acellular aorta)

半月板、正常血管和脫細胞血管基質(zhì) HE 染色（圖 2），可見半月板細胞外基質(zhì)含量豐富，正常半月板細胞呈圓形或橢圓形，細胞均勻分布基質(zhì)中（圖 2A）；正常血管細胞均勻分布于基質(zhì)中，基質(zhì)含量豐富，空隙少（圖 2B）；脫細胞血管基質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)血管細胞，基質(zhì)染色深度較正常血管淡，可見基質(zhì)中血管的孔隙明顯增加（圖 2C）。甲苯胺藍染色（1% 硼酸鹽法）可見正常半月板軟骨呈現(xiàn)紫紅色，背景呈現(xiàn)淡藍色（圖 3A）；正常血管呈強陽性（圖 3B），經(jīng)脫細胞后染色呈陽性（圖 3C）。血管和半月板組織天狼猩紅染色（圖 4），在普通顯微鏡下，正常半月板膠原緊密排列，呈亮紅色（圖4A），正常血管膠原纖維排列規(guī)則且致密（圖 4B），經(jīng)脫細胞后致密性變疏松，更利于細胞的貼附和增殖（圖 4C）；在偏振光顯微鏡下可觀察到，正常半月板中顯示很強雙折光性、呈強黃色或亮紅色的I 型膠原纖維和顯示弱的雙折光性、呈多種色彩的疏松網(wǎng)狀分布的 II 型膠原纖維（圖 4D）；在正常血管和脫細胞血管基質(zhì)中（圖 4E 和 F）同樣也發(fā)現(xiàn)顯示很強雙折光性，呈強黃色或亮紅色的 I 型膠原纖維。

2.3 血管脫細胞前后 Hoechst33258 染色

熒光顯微鏡下，血管 Hoechst33258 染色（圖5），可見熒光染色陽性的 DNA（熒光亮點）；正常血管可見 Hoechst33258 染色陽性（圖 5A），最后經(jīng)過脫細胞程序后，Hoechst33258 染色呈陰性（圖5B），未見明顯的細胞 DNA 物質(zhì)殘留。

2.4 材料細胞毒性檢測

在 MTT 法中，OD值越大，毒性越小且細胞活性越強。實驗結(jié)果如圖 6，培養(yǎng)的第1 天，細胞在清洗 1 d 組和 2 d 組之間沒有統(tǒng)計學差異，但這兩組和清洗 4 d 以及對照組之間有明顯的差異，而對照組和清洗 4 d 組之間沒有統(tǒng)計學差異。脫細胞血管基質(zhì)經(jīng)過一系列脫細胞程序處理后，清洗達 4 d 及以上能很好去除支架上殘留的各種試劑，對細胞無明顯毒性，同時能很好保留生物材料本身的細胞相容性。

圖4 半月板和脫細胞前后血管切片天狼猩紅染色（A：正常半月板明場；B：正常血管明場；C：脫細胞血管明場；D：正常半月板暗場；E：正常血管暗場；F：脫細胞血管暗場）Figure 4 Picrosirius red staining of the meniscus, normal aorta and acellular aorta (A: Normal meniscus in bright field; B: Normal aorta in bright field; C: Acellular aorta in bright field; D: Normal meniscus in dark field; E: Normal aorta in dark field; F: Acellular aorta in dark field)

圖5 脫細胞前后血管 Hoechst33258 染色（A：正常血管；B：脫細胞血管）Figure 5 Hoechst33258 staining of normal aorta and acellular aorta (A: Normal aorta; B: Acellular aorta)

2.5 脫細胞前后彈性模量

由血管組織在脫細胞程序處理前后彈性模量結(jié)果（表 1）可以發(fā)現(xiàn)，血管組織經(jīng)脫細胞前后，雖然環(huán)向、縱向的彈性模量和拉伸失敗應(yīng)力都存在一定的削減，相對縱向走行血管彈性模量削減的幅度，環(huán)向的削減幅度更小，但仍然具有良好的力學性能，與其他材料相比仍具有明顯的優(yōu)勢[5]。

圖6 清洗天數(shù)對脫細胞血管基質(zhì)材料毒性影響的 MTT實驗結(jié)果（*P ＜ 0.05）Figure 6 MTT experimental results on the cytotoxicity effect of washing days on the acellular vascular matrix (*P ＜ 0.05)

2.6 脫細胞前后膠原定量

按定量檢測試劑盒進行檢測和計算，脫細胞前血管基質(zhì)中羥脯氨酸含量為（3.078 ± 0.049）mg/g，脫細胞后為（2.018 ± 0.020）mg/g（圖 7）?？梢园l(fā)現(xiàn)膠原經(jīng)脫細胞后，存在一定程度的削減，但仍有三分之二左右膠原被保留。

表1 脫細胞前后血管的彈性模量Table 1 Elastic modulus of normal aorta and acellular aorta

圖7 脫細胞前后血管羥脯氨酸含量的測定結(jié)果（*P ＜0.05）Figure 7 Hydroxyproline content examination results of normal aorta and acellular aorta (*P ＜ 0.05)

2.7 兔半月板細胞復(fù)合脫細胞血管基質(zhì) SEM

掃描電鏡結(jié)果顯示，對照組血管經(jīng)脫細胞后無細胞殘留，表面光滑（圖 8A），接種半月板細胞的實驗組，可以看到明顯的細胞胞體，細胞錯落分布于血管基質(zhì)結(jié)構(gòu)中，黏附緊密（圖 8B）。

3 討論

半月板損傷和半月板切除術(shù)均會增加骨關(guān)節(jié)炎的風險。為了減輕短期疼痛并延緩骨關(guān)節(jié)炎的進展，最有可能的策略是替代或再生有缺陷的半月板。天然組織移植近來受到很多關(guān)注。由于自體組織來源受限的問題，目前臨床和科研往往采用異體組織，但異體組織存在排斥反應(yīng)等問題。為了擴大異種組織作為支架和生物移植的臨床應(yīng)用，當前需要開發(fā)抗原去除策略，同時要去除足夠的抗原含量以避免免疫排斥。循環(huán)冷凍和解凍，結(jié)合低滲溶液的物理方法被列為本研究抗原去除方案中的第一環(huán)節(jié)，其目的是通過滲透壓促使組織內(nèi)的細胞裂解，并掩蓋殘留抗原，輔助其他抗原去除方案，同時不會破壞組織細胞外基質(zhì)（ECM）[6-8]?；瘜W離子洗滌劑十二烷基硫酸鈉（SDS）作為我們脫細胞程序的中間環(huán)節(jié)，其目的是破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，去除細胞膜蛋白，減少抗原，從而減少支架的免疫原性。許多研究表明，用 SDS 處理的組織未見膠原蛋白含量明顯改變[9-11]，能很好保持其機械性能[12]。核酸酶（即核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶）作為脫細胞程序的最后一環(huán)，其目的是降解和促進異種組織抗原主要成分 RNA 和 DNA 的去除。據(jù)文獻報道，在抗原去除方案中，核酸酶未發(fā)現(xiàn)明顯的負面影響，如對 ECM 組分或機械性能[13-14]，再次保證了組織的力學性能。任何一種脫細胞方法的具體效果不能孤立，正確且合理的抗原去除方案應(yīng)將增強抗原去除和保留組織 ECM 的功效結(jié)合起來。故本研究采用三聯(lián)（物理、化學和酶聯(lián)）脫細胞程序處理動脈組織，采用不同的順序應(yīng)用，實現(xiàn)了不同性質(zhì)（如溶解度）抗原的逐步去除。通過Hoechst33258 染色證實脫細胞效果理想，殘留抗原含量明顯減少。

圖8 脫細胞血管基質(zhì)接種半月板細胞前后的掃描電鏡（A：脫細胞血管基質(zhì)；B：脫細胞血管基質(zhì)復(fù)合半月板細胞，紅色箭頭表示接種細胞很好貼附于血管基質(zhì)中）Figure 8 Scanning electron microscopy before and after plating meniscus cells with acellular vascular matrix (A: Acellular vascular matrix; B: Acellular vascular matrix composite meniscus cells; The red arrow indicates that the inoculated cells adhere well to the acellular vascular matrix)

在半月板的修復(fù)和再生機制中，實現(xiàn)半月板取向結(jié)構(gòu)以及天然成分的仿生，獲取更好的拉伸模量和生物相容性，才能更加利于組織再生。經(jīng)微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，脫細胞血管基質(zhì)表面的膠原纖維大小及其走向與正常的半月板一致，均成不規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能很好地將膝關(guān)節(jié)載荷轉(zhuǎn)化為膠原纖維的徑向形變，從而避免了各個方向作用力對半月板和材料造成撕裂的風險；脫細胞血管基質(zhì)環(huán)向走行的纖維與半月板半弧形主體纖維走向一致，能夠很好地保證材料的彈性模量，有助于抵抗張力并傳遞半月板的膝關(guān)節(jié)負荷。力學檢測結(jié)果顯示，纖維環(huán)向走行的脫細胞血管基質(zhì)比纖維縱向走行的脫細胞血管基質(zhì)的彈性模量更佳，這一結(jié)果證明取向結(jié)構(gòu)決定力學性能，脫細胞血管基質(zhì)實現(xiàn)了對天然半月板取向結(jié)構(gòu)的仿生，具有更好的拉伸模量。半月板兩大天然成分是纖維組分和蛋白多糖，其中I 型膠原蛋白不少于 90%[15]。而天狼猩紅染色結(jié)果證實，血管組織具有與半月板組織相同的 I 型膠原。而半月板和脫細胞血管組織的甲苯胺藍和天狼猩紅染色結(jié)果顯示，半月板和血管組織在膠原和糖胺多糖成分上無明顯的差別。進一步膠原定量結(jié)果顯示，血管組織經(jīng)過脫細胞后膠原得到大部分保留。這證實了脫細胞程序的有效性，且能很好避免有效成分的丟失，最終實現(xiàn)半月板天然成分的仿生。成分的相似決定良好的生物相容性。進一步MTT 法細胞毒性檢測證實，經(jīng)脫細胞程序后無明顯化學試劑的殘留，避免了對細胞相容性的影響，保證了材料本身無毒性優(yōu)勢，利于細胞黏附、增殖和分化。在最后的體外實驗研究中，我們設(shè)計了半月板纖維軟骨細胞接種到脫細胞基質(zhì)上并培養(yǎng)的實驗，可以看到細胞很好地貼附血管基質(zhì)表面生長，說明脫細胞血管基質(zhì)對半月板細胞具有良好的細胞相容性，證實了脫細胞血管基質(zhì)可用于半月板修復(fù)的可行性。

綜上所述，本研究新設(shè)計的抗原去除方案可以有效地裂解細胞并去除細胞核、細胞質(zhì)以及 DNA和 RNA 相關(guān)抗原，顯著降低抗原影響，同時該方案能很好保留 ECM 的結(jié)構(gòu)大分子和微結(jié)構(gòu)。另一方面，從成分和結(jié)構(gòu)上來看，脫細胞血管外基質(zhì)ECM 組分和空間結(jié)構(gòu)和天然半月板具有很好的相似性，能為軟骨細胞生長提供空間和環(huán)境，其生物相容性確保細胞活動并促進在半月板中的特異性細胞外基質(zhì)沉積，良好的力學特性能起到吸收振蕩，傳遞載荷，保護關(guān)節(jié)軟骨的作用。因此，在半月板組織工程和再生醫(yī)學中，脫細胞血管基質(zhì)支架具有應(yīng)用半月板組織再生和修復(fù)的巨大潛能，是未來組織工程半月板的重要支架之一。

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