BSL-4實驗室設(shè)施和關(guān)鍵設(shè)備生物防護(hù)風(fēng)險研究

胡凌飛，靳愛軍，張柯，劉波波，杜濤，李勁松，李娜

近年來，高致病性病原微生物引發(fā)的烈性傳染病在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)擴(kuò)散趨勢，新發(fā)突發(fā)傳染病的不斷暴發(fā)，人類社會公共健康和環(huán)境受到嚴(yán)重威脅，為保障國內(nèi)控制傳染病的突發(fā)事件應(yīng)急安全以及提升生物國防實力的重大需求，世界各國開始加緊建設(shè)高等級病原微生物實驗室[1-4]。2015 年初我國首個生物安全四級實驗室（BSL-4）在中國科學(xué)院武漢病毒所竣工，成為國內(nèi)首個生物安全防護(hù)等級最高的實驗室。

高等級生物安全實驗室風(fēng)險評估包括很多方面，有病原微生物危害評估、實驗室試驗活動風(fēng)險評估、設(shè)施設(shè)備安全風(fēng)險評估以及人員防護(hù)風(fēng)險評估等。設(shè)施設(shè)備硬件條件是確保生物安全的基礎(chǔ)，其中，一級防護(hù)屏障保護(hù)的目標(biāo)是實驗室工作人員，實現(xiàn)人員與操作對象（即感染性材料）之間的隔離，以消除或減少人員暴露于感染性材料。一級防護(hù)屏障包括動物隔離設(shè)備、生物安全柜、個人防護(hù)裝備等。二級防護(hù)屏障保護(hù)目標(biāo)是實驗室的外部環(huán)境，防止實驗中使用的感染性材料和實驗活動過程中產(chǎn)生的感染性材料擴(kuò)散到實驗室外，造成外環(huán)境污染，引發(fā)傳染性疾病的流行。二級防護(hù)屏障包括建筑結(jié)構(gòu)、通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)、消毒滅菌系統(tǒng)等[5-8]。本研究采用粘質(zhì)沙雷菌和噬菌體 ΦX174 作為高致病性細(xì)菌和病毒的替代物，通過替代微生物氣溶膠對 BSL-4 實驗室的設(shè)施和關(guān)鍵防護(hù)設(shè)備進(jìn)行生物防護(hù)風(fēng)險的研究，為高等級生物安全實驗室風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 實驗用菌株為粘質(zhì)沙雷菌8039 由本所保藏，大腸桿菌（ATCC13706）和大腸桿菌噬菌體 ΦX174（ATCC13706-B1）購于ATCC 菌種保藏中心。采用普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、普通營養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 生物氣溶膠發(fā)生采樣一體機(jī)和 Collison 氣溶膠發(fā)生器為美國 BGI 公司產(chǎn)品；Andersen 六級空氣微生物采樣器為青島眾瑞智能儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 生物防護(hù)效果測試系統(tǒng) BSL-4 實驗室設(shè)施和關(guān)鍵設(shè)備的生物防護(hù)效果測試系統(tǒng)包括生物氣溶膠發(fā)生單元、生物氣溶膠采集單元和生物氣溶膠進(jìn)樣單元，如圖 1 所示。利用此測試系統(tǒng)在運行正常的 BSL-4 實驗室內(nèi)測試生物安全設(shè)施設(shè)備是否存在生物安全風(fēng)險。實驗中氣溶膠發(fā)生器為Collison 氣溶膠發(fā)生器，高等級生物安全實驗室設(shè)施設(shè)備的下游生物氣溶膠濃度一般較低，因此下游生物氣溶膠采集單元采用 Andersen 六級采樣器。

圖1 生物防護(hù)效果測試系統(tǒng)構(gòu)成示意圖Figure 1 The schematic diagram of the biological protective test system

圖2 生物氣溶膠發(fā)生采樣一體機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖Figure 2 The structure sketch map of the microbiological aerosol sampling unit

根據(jù)高等級生物安全實驗室各種設(shè)施和關(guān)鍵設(shè)備對生物氣溶膠防護(hù)的要求，上游既包括生物氣溶膠發(fā)生，又有生物氣溶膠采樣，考慮到實驗現(xiàn)場的操作需求，采用了自主研制的生物氣溶膠發(fā)生采樣一體機(jī)，結(jié)構(gòu)如圖 2 所示。生物氣溶膠發(fā)生采樣一體機(jī)可將生物氣溶膠的發(fā)生與采樣集成為一體，在機(jī)體的左右兩側(cè)分別設(shè)計可以橫向和縱向抽拉的收縮桿，分別支撐生物氣溶膠發(fā)生器和采樣器，生物氣溶膠發(fā)生器的發(fā)生距離和高度可以在一定范圍內(nèi)調(diào)整。通過微控制器控制氣流流量、工作模式、工作時間等，儀器內(nèi)置藍(lán)牙通訊模塊，可以通過遙控器遠(yuǎn)距離控制儀器運行，避免了人為干擾和實驗人員的氣溶膠暴露危險。

1.2.2 實驗室設(shè)施對微生物氣溶膠防護(hù)效果的檢測方法

1.2.2.1 排風(fēng)高效空氣過濾器 生物氣溶膠發(fā)生單元在 BSL-4 實驗室的一個排風(fēng)高效空氣過濾器單元正下方 62 cm 處發(fā)生微生物氣溶膠，發(fā)生5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在排風(fēng)高效空氣過濾器單元下方 40 cm 處采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元在排風(fēng)高效空氣過濾器單元采樣口采集生物氣溶膠樣本 5 min，采樣后取出平皿進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)并計算防護(hù)效率（即排風(fēng)高效過濾器對微生物氣溶膠的過濾效率）。

1.2.2.2 氣密門 生物氣溶膠發(fā)生單元在四級實驗室的一個氣密門門縫正前方發(fā)生微生物氣溶膠，發(fā)生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在氣密門門縫正前方采集本底樣本 20 s。用下游生物氣溶膠采集單元在氣密門另一側(cè)的門縫正前方采集生物氣溶膠樣本 5 min，采樣過程中按“開門”按鈕使氣密門氣壓下降，模擬氣溶膠泄漏事故，采樣后取出平皿進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)并計算防護(hù)效率。

1.2.2.3 傳遞窗 生物氣溶膠發(fā)生單元分別在壓力為 –70 Pa 的傳遞窗和 –40 Pa 的實驗室里發(fā)生微生物氣溶膠，發(fā)生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元采集生物氣溶膠樣本 5 min，如圖 3A 和圖 3B 所示，采樣后取出平皿進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)并計算防護(hù)效率。

1.2.3 實驗室關(guān)鍵設(shè)備對微生物氣溶膠防護(hù)效果的檢測方法

1.2.3.1 動物飼養(yǎng)隔離器

小動物飼養(yǎng)隔離器檢測：因小動物飼養(yǎng)隔離器較小放不下氣溶膠發(fā)生裝置，所以氣溶膠發(fā)生單元在小動物飼養(yǎng)隔離器外通往總排風(fēng)管道的一個排風(fēng)口發(fā)生微生物氣溶膠，發(fā)生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在此隔離器的同一個排風(fēng)管的下方排風(fēng)口采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元在小動物飼養(yǎng)隔離器的總排風(fēng)管道高效過濾器口采集生物氣溶膠樣本 5 min，采樣后取出平皿進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)并計算防護(hù)效率。

中型動物飼養(yǎng)隔離器檢測：生物氣溶膠發(fā)生單元在中型動物飼養(yǎng)隔離器的隔離艙內(nèi)發(fā)生微生物氣溶膠，發(fā)生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在中型動物飼養(yǎng)隔離器的隔離艙內(nèi)口采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元在中型動物飼養(yǎng)隔離器的排風(fēng)口采集生物氣溶膠樣本 5 min，采樣后取出平皿進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)并計算防護(hù)效率。

圖3 傳遞窗防護(hù)效率測試示意圖（A：在 –70 Pa 的傳遞窗里發(fā)生氣溶膠；B：在 –40 Pa 的實驗室里發(fā)生氣溶膠）Figure 3 The schematic diagram of the transfer window (A: Bioaerosols occur in the –70 Pa transfer window; B: Bioaerosols occur in the –40 Pa laboratory)

1.2.3.2 正壓防護(hù)服 在 6 m2的密閉空間內(nèi)，實驗人員穿上正壓防護(hù)服，連接生命支持系統(tǒng)，用生物氣溶膠發(fā)生單元在正壓防護(hù)服外發(fā)生微生物氣溶膠，發(fā)生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在發(fā)生單元前方采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元在正壓防護(hù)服內(nèi)采集生物氣溶膠樣本5 min，采樣過程中斷開生命支持系統(tǒng)，模擬正壓防護(hù)服無正壓狀態(tài)，采樣后取出平皿進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)并計算防護(hù)效率。

1.2.3.3 生物安全柜高效過濾器 在生物安全柜正常運行的情況下，用生物氣溶膠發(fā)生單元在生物安全柜內(nèi)發(fā)生微生物氣溶膠，發(fā)生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在發(fā)生單元前方采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元在排風(fēng)高效空氣過濾器單元采樣口采集生物氣溶膠樣本 5 min，采樣后取出平皿進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)并計算防護(hù)效率（即排風(fēng)高效過濾器對微生物氣溶膠的過濾效率）。

1.2.4 微生物氣溶膠粒徑的測量 將采樣平皿放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)（或噬菌斑數(shù)），根據(jù)各級采樣平板的校正菌落數(shù)（噬菌斑數(shù)）[9]計算氣溶膠顆粒數(shù)量中值直徑。依據(jù) Anderson 六級采樣器每一級捕獲的粒子大小不同（一級 〉 7 μm、二級為 4.8 ～ 7 μm、三級為3.4 ～ 4.7 μm、四級為 2.1 ～ 3.3 μm、五級為 1.1 ～2.0 μm、六級為 0.6 ～ 1.0 μm），把六級采樣器捕獲的粒子作為 6 組大小不同數(shù)據(jù)，根據(jù)偏態(tài)分布50% 中值直徑的計算公式進(jìn)行計算。

數(shù)量中值直徑公式：P50= L +（i/f）（50%n – C）。公式中 L 為累計頻數(shù)中值的組距下限；i 為累計頻數(shù)中值的組距；f 為累計頻數(shù)中值的粒子數(shù)；50%n為累計頻數(shù)中值所在組的累計頻數(shù)；C 為累計頻數(shù)中值[10]。

1.2.5 微生物氣溶膠防護(hù)效果計算方法 粘質(zhì)沙雷菌采樣平板 30 ℃ 恒溫培養(yǎng) 24 ～ 48 h，大腸桿菌噬菌體 ΦX174 采樣平板倒上層后 37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 24 h。Andersen 六級采樣平板按照文獻(xiàn)[2]校正后的菌落數(shù)（或噬菌斑數(shù)）及采樣流量（28.3 L/min）、采樣時間計算設(shè)施和關(guān)鍵設(shè)備對微生物氣溶膠的防護(hù)效率。

⑴上游微生物氣溶膠濃度（CFU/m3或PFU/m3）的計算：

⑵下游微生物氣溶膠濃度（CFU/m3或PFU/m3）的計算：

⑶實驗室設(shè)施和關(guān)鍵設(shè)備對微生物氣溶膠的防護(hù)效率：P =（1 – At/A0）× 100%

2 結(jié)果

2.1 微生物氣溶膠粒子大小

粘質(zhì)沙雷菌氣溶膠顆粒數(shù)量中值直徑平均為2.21 μm，噬菌體 ΦX174 氣溶膠顆粒數(shù)量中值直徑平均為 2.18 μm。

2.2 實驗室設(shè)施防護(hù)效果

本研究所測試的生物安全四級實驗室設(shè)施對生物氣溶膠的防護(hù)效率基本達(dá)到 99.9% 以上，氣密門在模擬意外泄漏操作的情況下依然達(dá)到超過99.99% 的防護(hù)效率（表 1）。

2.3 實驗室關(guān)鍵設(shè)備的防護(hù)效果

生物安全四級實驗室關(guān)鍵設(shè)備對生物氣溶膠的防護(hù)效率都達(dá)到了 99.99% 以上，正壓防護(hù)服在模擬生命支持系統(tǒng)斷開，發(fā)生意外的情況下也達(dá)到超過 99.99% 的防護(hù)效率（表 2）。

表1 BSL-4 實驗室設(shè)施防護(hù)效果測試結(jié)果Table 1 Test results of protective effect of facilities in BSL-4 laboratory

表2 BSL-4 實驗室關(guān)鍵設(shè)備防護(hù)效果測試結(jié)果Table 2 Test results of protective effect of key equipment in BSL-4 laboratory

3 討論

對生物安全實驗室來說，設(shè)施設(shè)備等硬件是基礎(chǔ)，是生物安全實驗室建設(shè)最重要的一個環(huán)節(jié)，符合國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，具備良好的防護(hù)效果是保障實驗室生物安全，確保實驗活動正常開展的前提[8]。生物安全實驗室在施工完成后所有設(shè)施和關(guān)鍵設(shè)備都要經(jīng)過具備專業(yè)檢測資質(zhì)/資格的第三方檢測機(jī)構(gòu)依據(jù)相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行現(xiàn)場測試，如高等級生物安全實驗室排風(fēng)高效過濾器測試法有掃描/全效率撿漏法[1]，圍護(hù)結(jié)構(gòu)及氣密門檢測有壓力衰減法[11]、煙霧檢測法，動物隔離設(shè)備有內(nèi)外壓差法等。這些檢測方法一般通過檢測壓力變化或發(fā)生無生物活性的物理顆粒氣溶膠進(jìn)行檢漏測試，但鈉鹽霧、固體粉塵或油性顆粒等物理粒子，與生物氣溶膠粒子理化性質(zhì)不同?？諝馕⑸锬Ｊ郊?xì)菌粘質(zhì)沙雷菌是細(xì)菌中最小者，常用于檢測濾菌器質(zhì)量，國外使用的模擬病毒指示微生物噬菌體 MS2 多用于濾材過濾效果評價[12-13]。不同種類的微生物氣溶膠具有不同的粒徑分布特征，其中病毒、支原體和細(xì)菌等粒徑主要集中在 2 μm 以下，室內(nèi)微生物氣溶膠粒徑為 1 ～ 10 μm，粒徑小于 10 μm 的粒子能較長時間飄浮在空氣中，并可被人呼吸系統(tǒng)吸入[12,14]。本研究人工發(fā)生的粘質(zhì)沙雷菌和噬菌體 ΦX174氣溶膠顆粒主要分布于 1.1 ～ 4.7 μm 之間，其數(shù)量中值直徑分別為 2.21 μm 和 2.18 μm，位于室內(nèi)空氣微生物氣溶膠粒子大小范圍內(nèi)，因此可以真實地模擬致病性生物氣溶膠粒子發(fā)生泄漏后正常運行著的實驗室設(shè)施設(shè)備對其的防護(hù)效果，同時也是對物理氣溶膠粒子測試法的進(jìn)一步驗證。

測試結(jié)果表明 BSL-4 實驗室內(nèi)的設(shè)施設(shè)備在正常運行的情況下，發(fā)生生物氣溶膠泄漏風(fēng)險的概率很小。實驗室硬件設(shè)施固然重要，而如何確保硬件設(shè)施科學(xué)、有效地安全運行和維護(hù)保養(yǎng)更為重要，設(shè)施設(shè)備的日常運行管理要包括正常操作使用、日常維護(hù)保養(yǎng)、定期檢測等[8]。實驗室生物安全風(fēng)險評估應(yīng)由多項評估方案共同構(gòu)成，完善的硬件設(shè)施，實驗人員職業(yè)培訓(xùn)加上科學(xué)有效的組織管理體系、管理機(jī)制和管理制度才能在最大程度上降低安全風(fēng)險。

[1] Zhang X. Research on key issues and development strategies of biosafety level 4 laboratory. Beijing: Academy of Military Medical Sciences, 2016. (in Chinese)章欣. 生物安全 4級實驗室建設(shè)關(guān)鍵問題及發(fā)展策略研究. 北京:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2016.

[2] Zaki AN. Biosafety and biosecurity measures: management of biosafety level 3 facilities. Int J Antimicrob Agents, 2010, 36 Suppl 1:S70-S74.

[3] Liang HG, Huang C, Ma HX, et al. High-level biosafety laboratories and biosafety. Bull Chin Acad Sci, 2016, 31(4):452-456. (in Chinese)梁慧剛, 黃翠, 馬海霞, 等. 高等級生物安全實驗室與生物安全.中國科學(xué)院院刊, 2016, 31(4):452-456.

[4] Shurtleff AC, Garza N, Lackemeyer M, et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses, 2012, 4(12):3932-3951.

[5] General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China, Standardization Administration of the People's Republic of China. GB 19489-2008 Laboratories—General requirements for biosafety. Beijing: China Standards Press, 2009. (in Chinese)中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局, 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會. GB 19489-2008 實驗室 生物安全通用要求. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2009.

[6] National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. WS 233-2017 General biosafety standard for causative bacteria laboratories. (in Chinese)中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. WS 233-2017 病原微生物實驗室生物安全通用準(zhǔn)則.

[7] Meng KY, Wang CY, Wan ZH. Describe the safety precaution of high level biological safety laboratory. Disaster Med Rescue (Electron Ed),2017, 6(2):112-115. (in Chinese)孟軻音, 王承宇, 萬忠海. 試述高等級生物安全實驗室的安全防范.災(zāi)害醫(yī)學(xué)與救援(電子版), 2017, 6(2):112-115.

[8] Zhao SQ, Wang H, Li P. Facility & equipment of bio-safety laboratory.Beijing: Military Medical Press, 2017:1-17. (in Chinese)趙四清, 王華, 李萍. 生物安全實驗室設(shè)施與設(shè)備. 北京: 軍事醫(yī)學(xué)出版社, 2017:1-17.

[9] Andersen A. New sampler for the collection, sizing, and enumeration of viable particles. J Bacteriol, 1958, 76(5):471-484.

[10] Hu LP. Test medical research design and statistical analysis. Beijing:People's Medical Publishing House, 2004:238. (in Chinese)胡良平. 檢驗醫(yī)學(xué)科研設(shè)計與統(tǒng)計分析. 北京: 人民軍醫(yī)出版社,2004:238.

[11] Cao GQ, Wang R, Zhai PJ. Discussion on building envelope air tightness test of high-level biosafety laboratories. Heating Ventilating Air Conditioning, 2016, 46(12):74-79. (in Chinese)曹國慶, 王榮, 翟培軍. 高等級生物安全實驗室圍護(hù)結(jié)構(gòu)氣密性測試的幾點思考. 暖通空調(diào), 2016, 46(12):74-79.

[12] Yu L. Model virus (phage) separation, characterization and application research in the evaluation of protective equipment and facilities.Beijing: Academy of Military Medical Sciences, 2010. (in Chinese)于龍. 模式病毒(噬菌體)分離、特性及在防護(hù)裝備和設(shè)施評價中的應(yīng)用研究. 北京: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2010.

[13] Wen ZB, Chen Y, Du Q, et al. Contamination of microbiological aerosol generated by pathogenic microbiological labs. Milit Med Sci,2013, 37(1):1-5. (in Chinese)溫占波, 陳詠, 杜茜, 等. 病原微生物實驗室實驗操作對室內(nèi)空氣產(chǎn)生微生物污染的研究. 軍事醫(yī)學(xué), 2013, 37(1):1-5.

[14] Che FX, Yu XH. The theory and application of air microbiological inspection. Beijing: Enyclopedia of China Publishing House, 1998. (in Chinese)車鳳翔, 于璽華. 空氣微生物采樣理論及其技術(shù)應(yīng)用. 北京: 中國大百科全書出版社, 1998.