CXCL10與CXCL12基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的關(guān)系

邢志偉，高艷軍，張建武△，張珣，孫紅梅

肺結(jié)核是經(jīng)過(guò)空氣傳播的慢性傳染病，主要由結(jié)核分枝桿菌感染引起，全世界每年約900萬(wàn)的肺結(jié)核新發(fā)病例，其中大約有140萬(wàn)人死亡［1-2］。我國(guó)的結(jié)核病疫情仍然處于較高水平［3］，控制形勢(shì)依然嚴(yán)峻。機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫防御主要是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，其中趨化因子發(fā)揮了多種生物學(xué)功能。最近研究表明，趨化因子作為一種早期炎癥介質(zhì)起著重要作用，它決定了宿主接觸病原體后的免疫反應(yīng)［4］。趨化因子CXCL10與CXCL12可以趨化炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)多種細(xì)胞釋放炎癥因子，起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抗病毒、抗腫瘤等作用。趨化因子基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)存在基因多態(tài)性，這些基因的多態(tài)性可能改變趨化因子的表達(dá)水平、穩(wěn)定性以及與受體之間的相互作用。因此，趨化因子基因的多態(tài)性與疾病進(jìn)展的程度有關(guān)。實(shí)際上感染結(jié)核分枝桿菌的人群中約90%沒(méi)有臨床癥狀。有研究表明肺結(jié)核感染存在宿主的遺傳差異，個(gè)體遺傳基因多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性有關(guān)［5］。本文選取趨化因子CXCL10與CXCL12的基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleo-tide polymorphism，SNP）位點(diǎn)進(jìn)行研究，探討CXCL10-135G/A和CXCL12-801G/A基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年10月—2017年3月在我院結(jié)核內(nèi)科住院的102例初治肺結(jié)核痰涂片陽(yáng)性患者作為病例組，其中男 59 例，女 43例，年齡 19～60歲，平均（38.2±11.7）歲。肺結(jié)核診斷參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS288-2008），以病原學(xué)或組織病理學(xué)證實(shí)為主，輔助檢查結(jié)核菌素試驗(yàn)（PPD）陽(yáng)性，結(jié)合典型的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)證據(jù)，進(jìn)行綜合分析作出診斷。收集同期來(lái)自我院體檢中心的115例健康體檢者為對(duì)照組，其中男68例，女47例，年齡24～61 歲，平均（39.1±10.3）歲。所有研究對(duì)象均為漢族，均無(wú)合并糖尿病、腫瘤、自身免疫性疾病及其他慢性感染性疾病，如病毒性肝炎、人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）感染等。2組人群年齡（t=0.600）、性別（χ2=0.037）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究所收集的標(biāo)本均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及志愿者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與儀器 基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。引物購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。限制性?xún)?nèi)切酶BstBⅠ和MspⅠ購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。Taq PCR Master Mix體系購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。PCR擴(kuò)增儀（LightCycler 480Ⅱ，Roche公司）。凝膠圖像處理系統(tǒng)（Tanon-1600，上海天能科技有限公司）。電泳儀（DYY-6C，北京市六一儀器廠(chǎng)）。Nanodrop核酸分析儀［ND2000，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的抽提 抽取患者及體檢者空腹靜脈血2 mL，置于含乙二胺四乙酸（EDTA）真空管抗凝，使用全血基因組DNA提取試劑盒，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。4℃冰箱保存提取的DNA，備用。

1.3.2 DNA濃度的測(cè)定 取DNA樣品2μL，于Nanodrop核酸分析儀檢測(cè)DNA濃度以及260 nm和280 nm處光密度（OD）值，測(cè)定濃度均為 40 g/L以上，OD260/OD280在 1.7～1.9樣品即為合格DNA。

1.3.3 PCR反應(yīng)檢測(cè)目的基因 體系包括1μL DNA模板，2μL 10×PCR緩沖液（含Mg2+），0.3μL TaqDNA聚合酶（5 U/μL），0.5 μL dNTP（10 mmol/L），上、下游引物各 0.5 μL（10 mmol/L），用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊，體系總共20μL。CXCL10-135G/A 引物：上游 5′-CCGTTCATGTTTTGGAAAGTGA-3′，下 游 5′-GGGAAGTCCCATGTTGCAGATT-3′。 CXCL12-801G/A 引物：上游 5′-CAGTCAACCTGGGCAAAGCC-3′，下游 5′-AGCTTTGGTCCTGAGAGTCC-3′。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物的酶切反應(yīng)及電泳 對(duì)目的基因PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，體系包括10μL PCR產(chǎn)物，各0.5μL限制性?xún)?nèi)切酶，2μL 10×buffer緩沖液，7.0μL滅菌去離子水，總體系20μL?；靹蚍?7℃水浴12 h，取酶切產(chǎn)物10μL上樣于適量溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠中，在1×Tris-硼酸-EDTA（TBE）電泳緩沖液中，80 V恒壓電泳約40 min，最后在自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴(kuò)增條帶及酶切結(jié)果并記錄。進(jìn)行成像分析后準(zhǔn)確判斷酶切產(chǎn)物大小。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所得數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較進(jìn)行2獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；基因型及基因頻率以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)各組樣本代表性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型的遺傳平衡分析 結(jié)果顯示，2組CXCL10-135G/A和CXCL12-801G/A位點(diǎn)基因型符合 Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），病例組和對(duì)照組樣本均具有群體代表性，見(jiàn)表1。

Tab.1 The distribution of genotypes in two groups表1 2組基因型分布情況 觀察值（理論值）

2.2 PCR-RFLP分析

2.2.1 CXCL10-135G/A及CXCL12-801G/A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片段分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切電泳后，CXCL10-135G/A SNP位點(diǎn)GG基因型顯示為123 bp一條片段，AA基因型顯示為100 bp一條片段，GA基因型顯示為123 bp和100 bp兩條片段，見(jiàn)圖1。CXCL12-801G/A SNP位點(diǎn)GG基因型顯示為202 bp和100 bp兩條片段，AA基因型顯示為302 bp一條片段，GA基因型顯示為302 bp、202 bp和100 bp三條片段，見(jiàn)圖2。

2.2.2 CXCL10和CXCL12基因型及等位基因分析 CXCL10-135G/A多態(tài)性基因型及等位基因的分布頻率在病例組及對(duì)照組中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），病例組G等位基因的分布頻率高于對(duì)照組，A等位基因的分布頻率低于對(duì)照組，見(jiàn)表2。CXCL12-801G/A多態(tài)性基因型及等位基因在分布頻率在病例組及對(duì)照組中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表 3。

Fig.1 Enzyme digestion results of PCR product of CXCL10-135 gene圖1 CXCL10-135基因的PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

Fig.2 Enzyme digestion results of PCR product of CXCL12-801 gene圖2 CXCL12-801基因的PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

Tab.2 Distribution of genotype frequency and allele frequency of CXCL10-135G/A表2 CXCL10-135G/A基因型頻率及等位基因頻率分布例（%）

Tab.3 Distribution of genotype frequency and allele frequency of CXCL12-801G/A表3 CXCL12-801G/A基因型頻率及等位基因頻率分布例（%）

3 討論

3.1 宿主對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫防御 結(jié)核分枝桿菌可能侵入人體全身各器官，但主要侵犯肺臟，稱(chēng)為肺結(jié)核病。結(jié)核分枝桿菌主要通過(guò)呼吸道進(jìn)入肺泡，被中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等吞噬［6］，引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。上述這些靶細(xì)胞可啟動(dòng)趨化因子和細(xì)胞因子等級(jí)聯(lián)反應(yīng)。趨化因子是一類(lèi)結(jié)構(gòu)和功能相似的小分子細(xì)胞因子，可以特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面受體，通過(guò)G蛋白把信號(hào)傳入胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)下游信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而激活靶細(xì)胞，趨化單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等到達(dá)炎癥或感染部位，最終發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)輸和黏附等多種生物學(xué)作用。結(jié)核病發(fā)病的宿主遺傳因素和趨化因子的作用密切相關(guān)，趨化因子基因多態(tài)性在治療反應(yīng)、基因調(diào)控和疾病轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用［7］。

3.2 趨化因子CXCL10與肺結(jié)核易感的相關(guān)性 趨化因子可以分為 4個(gè)亞族——C、CC、CXC和CX3C。CXCL10即γ干擾素（IFN-γ）誘導(dǎo)蛋白10（IP-10），屬于CXC類(lèi)的趨化因子，由IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生，其生物學(xué)功能包括募集中性粒細(xì)胞，促進(jìn)多種細(xì)胞因子分泌，參與感染性疾病如結(jié)核病、病毒性肝炎及惡性腫瘤等發(fā)病。有資料表明CXCL10參與結(jié)核免疫，用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原肽刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IP-10的水平比血漿明顯增加，并且肺結(jié)核組顯著高于潛伏感染組和常見(jiàn)肺病組［8］。還有研究顯示IP-10可能成為活動(dòng)性肺結(jié)核與潛伏性結(jié)核的鑒別診斷指標(biāo)［9］。CXCL10基因在病毒性肝炎的免疫反應(yīng)及呼吸道病原體的固有免疫應(yīng)答中起著重要作用［10-11］。CXCL10基因啟動(dòng)子區(qū)存在多態(tài)性位點(diǎn)，可以調(diào)節(jié)基因靶位點(diǎn)與核內(nèi)蛋白的親和力，影響核因子（NF）-κB表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活作用，最終調(diào)控該基因的表達(dá)及趨化因子的表達(dá)水平［12］。本研究采用PCR-RFLP技術(shù)研究趨化因子CXCL10-135G/A位點(diǎn)SNP與肺結(jié)核易感相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病例組與對(duì)照組GG、GA和AA三種基因型分布頻率以及G、A等位基因分布頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，CXCL10啟動(dòng)子區(qū)的-135G/A多態(tài)性位點(diǎn)可能是影響肺結(jié)核發(fā)病易感性的基因位點(diǎn)，這與Tang等［13］的研究結(jié)果一致。

3.3 趨化因子CXCL12與肺結(jié)核易感的相關(guān)性 CXCL12屬于CXC類(lèi)趨化因子，又稱(chēng)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（stromal cell-derived factor，SDF），具有多種生物學(xué)功能，可以促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)及淋巴細(xì)胞分化發(fā)育等［14-15］。有研究發(fā)現(xiàn)胸腔積液中CXCL12水平升高，可能是診斷結(jié)核性胸膜炎的標(biāo)志物［16］。CXCL12是一種作用于前B細(xì)胞的刺激因子，最初在小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子中被發(fā)現(xiàn)。CXCL12-801G/A是人群遺傳變異中較常見(jiàn)的一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，指CXCL12的基因3′非翻譯區(qū)（UTR）第 801位堿基發(fā)生 G→A的突變。CXCL12-G801A基因突變位于編碼CXCL12β轉(zhuǎn)錄子高度保守的片段，可以通過(guò)改變基因的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達(dá)而影響CXCL12的表達(dá)，該基因G801A位點(diǎn)的多態(tài)性與其他疾病的關(guān)系已有報(bào)道，如HIV感染及移植排斥反應(yīng)等［17-18］，但與肺結(jié)核病易感的研究報(bào)道較少。本研究應(yīng)用PCR-RFLP分析趨化因子CXCL12801G/A位點(diǎn)SNP與結(jié)核病易感相關(guān)性，結(jié)果顯示CXCL12-801G/A基因位點(diǎn)三種基因型分別為GG、GA和AA，2組基因型及等位基因頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)CXCL12-801G/A基因位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性可能無(wú)關(guān)。

綜上，在機(jī)體控制結(jié)核分枝桿菌的感染免疫中，趨化因子的基因多態(tài)性參與細(xì)胞免疫應(yīng)答的過(guò)程，筆者采用PCR-RFLP技術(shù)證實(shí)了趨化因子CXCL10-135G/A基因多態(tài)性與肺結(jié)核發(fā)病可能相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)病例組和對(duì)照組標(biāo)本均來(lái)自于我院，由于肺結(jié)核的發(fā)病不僅有宿主的遺傳因素，還有個(gè)體差異、地域、環(huán)境因素等影響，這是本研究的局限之處。因此進(jìn)一步尋找肺結(jié)核病遺傳易感性基因，進(jìn)行多位點(diǎn)及多因素結(jié)合分析，對(duì)于結(jié)核病的防治和早期診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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