利用NSCLC 患者ROSE 細(xì)胞學(xué)制片進(jìn)行EGFR、KRAS、PIK3CA 基因檢測(cè)可行性的研究

胥京京，馮靖，曹潔

目前，肺癌的發(fā)病率和病死率居于所有惡性腫瘤之首［1-3］。由于肺癌早期癥狀隱匿，約70%患者確診時(shí)已處于疾病晚期，大多數(shù)已經(jīng)錯(cuò)失了外科手術(shù)機(jī)會(huì)［4-5］。晚期肺癌患者 5年生存率僅為17.7%［6］。近年來(lái)，靶向藥物的出現(xiàn)為晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者提供了一種新的治療手段，而腫瘤細(xì)胞基因突變的檢測(cè)結(jié)果也成為了指導(dǎo)晚期NSCLC患者個(gè)體化治療的重要依據(jù)［7］。目前大多數(shù)國(guó)內(nèi)外機(jī)構(gòu)主要利用NSCLC患者組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行基因突變檢測(cè)，但在一些特殊情況下，例如鉗夾病灶時(shí)大量出血不能繼續(xù)取材，因而無(wú)法取到足夠的組織標(biāo)本、經(jīng)支氣管鏡針吸活檢（TBNA）獲取的組織標(biāo)本量小，現(xiàn)有的組織學(xué)標(biāo)本僅夠用于病理診斷而無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行基因檢測(cè)，因此積極探索NSCLC可替代標(biāo)本進(jìn)行基因檢測(cè)具有重要的臨床意義。本研究旨在探討應(yīng)用氣管鏡取材過(guò)程中現(xiàn)場(chǎng)制做的快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)（ROSE）細(xì)胞學(xué)制片（ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本）作為基因檢測(cè)替代標(biāo)本，利用xTAG70plex液相芯片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、KRAS和PIK3CA基因突變檢測(cè)是否具有可行性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 連續(xù)納入2016年6月—2017年6月就診于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院行支氣管鏡檢查并經(jīng)最終病理診斷為NSCLC的患者，嚴(yán)格按照納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，共收集75例組織學(xué)標(biāo)本和ROSE細(xì)胞學(xué)制片配對(duì)的病例，男33例，女42例，平均年齡（58.84±11.01）歲。其中49例標(biāo)本來(lái)自肺原發(fā)病灶的肺活檢（TBLB），5例來(lái)自黏膜活檢（EBB），21例來(lái)自縱隔淋巴結(jié)穿刺活檢（TBNA）。組織學(xué)病理根據(jù)WHO 2015分類(lèi)，分為61例腺癌，14例鱗狀細(xì)胞癌；TNM分期：Ⅲa期12例，Ⅲb期24例，Ⅳ期39例。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)氣管鏡行TBLB、EBB或者TBNA獲得組織學(xué)標(biāo)本者。（2）組織學(xué)標(biāo)本經(jīng)病理診斷為NSCLC。（3）每例患者術(shù)中均制作了ROSE細(xì)胞學(xué)制片。（4）告知患者研究事項(xiàng)并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理學(xué)診斷為小細(xì)胞肺癌或組織學(xué)病理診斷分類(lèi)不清者。（2）有嚴(yán)重心、肺、腦等疾病不能耐受手術(shù)者。（3）凝血功能?chē)?yán)重障礙者。（4）未制作ROSE細(xì)胞學(xué)制片者。

1.2 主要試劑與設(shè)備 迪夫快速細(xì)胞染色液A、B液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；活檢鉗（JHY-FB-18-105-O-OA1，常州市久虹醫(yī)療器械有限公司）；王氏組織穿刺針（MW-319，美國(guó)ConMed公司）；常規(guī)支氣管鏡（外徑5.5 mm，BFF260）、超細(xì)支氣管鏡（外徑 4 mm，BF-P-260F）、虛擬支氣管鏡導(dǎo)航軟件（DirectPath V1.02，Cybernet Systems）、內(nèi)鏡超聲系統(tǒng)（MAJ-935）、外部直徑為1.4 mm的20 MHz腔內(nèi)超聲探頭（UM-S20-17S）和引導(dǎo)鞘套裝（K201/K203）、顯微鏡（CX31）、解剖顯微鏡（SZX7）均購(gòu)自?shī)W林巴斯公司；基因組DNA抽提試劑盒（NucleoSpin Blood，吉泰生物）；液相芯片試劑盒購(gòu)自益善生物技術(shù)股份有限公司；液相基因芯片系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Luminex公司。

1.3 方法

1.3.1 獲取組織學(xué)標(biāo)本 患者術(shù)前禁食水6 h，確保術(shù)前7 d內(nèi)沒(méi)有使用抗凝血藥物，給予2%利多卡因5 mL霧化吸入20 min，患者取仰臥位，經(jīng)鼻導(dǎo)管給氧，檢測(cè)血壓、心率和血氧飽和度。氣管鏡經(jīng)鼻腔進(jìn)入主支氣管，根據(jù)每位患者病灶部位、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況，依據(jù)ROSE的診斷性介入肺臟病學(xué)標(biāo)準(zhǔn)取材技術(shù)以及常規(guī) TBNA技術(shù)［8-9］，選擇性地采用TBLB、EBB、TBNA獲取組織學(xué)標(biāo)本，在保證患者安全的情況下，盡可能多地取得組織學(xué)標(biāo)本，獲取的組織學(xué)標(biāo)本分別送病理學(xué)檢查及裝于EP管中置于-80℃冰箱保存。

1.3.2 ROSE細(xì)胞學(xué)制片 依據(jù)ROSE的臨床實(shí)施指南［10］，用2.5 mL的一次性注射器針頭將僅有的極少的組織粒從活檢鉗鉗杯中挑起，或從組織針尖端推出，在無(wú)菌細(xì)胞學(xué)專(zhuān)用玻片染色端自?xún)?nèi)向外涂出厚薄均勻、直徑約1 cm的圓形，空氣中晾干后將涂片依次放入迪夫快速細(xì)胞學(xué)染色液A、B液中完成ROSE染色，1名經(jīng)驗(yàn)豐富的細(xì)胞學(xué)醫(yī)師立即于顯微鏡下觀察細(xì)胞成分、形態(tài)及細(xì)胞背景、挑揀并確保送檢的ROSE細(xì)胞學(xué)制片上具有足夠的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因檢測(cè)，在ROSE細(xì)胞學(xué)制片上當(dāng)腫瘤細(xì)胞數(shù)量大于總細(xì)胞數(shù)量的50%判斷為腫瘤細(xì)胞數(shù)量足夠用于EGFR、KRAS和PIK3CA基因檢測(cè)。ROSE細(xì)胞學(xué)制片在常溫干燥的環(huán)境下即可保存。每位患者至少制作出2張ROSE細(xì)胞學(xué)制片。

1.3.3 DNA提取 在解剖顯微鏡下將ROSE細(xì)胞學(xué)制片上藍(lán)色深染的腫瘤細(xì)胞用手術(shù)刀片刮下，分離出腫瘤細(xì)胞；DNA提取按照DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，經(jīng)過(guò)裂解、消化、純化后，把上面裝有絮狀DNA無(wú)水乙醇溶液的離心管離心5 min，離心速率13 000 r/min。棄去上層液，留下DNA沉淀。吸取950μL 70%乙醇至上面有DNA沉淀的離心管中，輕輕翻轉(zhuǎn)2次，120 r/min離心5 min，棄去上層液。離心管放置數(shù)分鐘，使管內(nèi)乙醇蒸發(fā)干凈。吸取30～100μL保存液到上面附著DNA的離心管中（保存液的量根據(jù)組織大小而定），輕輕拍打，使附在管壁上的DNA彌散到保存液中，先置于室溫10 min，加速DNA溶解，再4℃保存。

1.3.4 EGFR、KRAS和PIK3CA基因突變檢測(cè) xTAG70plex液相芯片檢測(cè)EGFR、KRAS和PIK3CA基因突變操作按照益善基因突變檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。主要包括以下5個(gè)步驟：（1）多重PCR獲得各基因外顯子上含有常見(jiàn)等位基因型的基因片段。（2）核酸外切酶酶切及堿性磷酸酶（EXOSAP）水解，去除多余的引物和dNTP。（3）等位基因特異性引物延伸（allele specific primer extension，ASPE）反應(yīng)。（4）ASPE引物上的Tag序列與聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列特異結(jié)合，即雜交反應(yīng)。（5）雜交后的微球通過(guò)Luminex 200多功能流式點(diǎn)陣儀分析，讀取每個(gè)樣品的中位熒光值。以組織學(xué)標(biāo)本檢測(cè)所得結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。在這75例患者中，由于PIK3CA檢出率過(guò)低（1/75，1.3%），無(wú)法進(jìn)行相關(guān)比較，筆者僅對(duì)EGFR和KRAS進(jìn)行相關(guān)比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本配對(duì)組織學(xué)標(biāo)本基因突變敏感度、特異度、一致率。

Tab.1 The comparision of KRAS mutation results between ROSE cytology group and histology group表1 組織學(xué)標(biāo)本與ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本KRAS基因突變比較 （例）

2 結(jié)果

2.1 ROSE鏡下表現(xiàn) 典型的肺腺癌在光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)為癌細(xì)胞嗜堿呈藍(lán)色深染，體積較大，呈圓形或類(lèi)圓形，密集成團(tuán)分布，呈桑葚樣排列，胞漿豐富，可有空泡，呈高分泌樣，見(jiàn)圖1。典型的肺鱗狀細(xì)胞癌在光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)為癌細(xì)胞形狀不規(guī)則、大小不一、呈多角形，胞漿角化，部分少漿、裸核，細(xì)胞核大小不規(guī)則，畸形明顯，見(jiàn)圖2。肺鱗癌ROSE細(xì)胞學(xué)制片壞死背景明顯，可見(jiàn)紅細(xì)胞、炎細(xì)胞、壞死細(xì)胞殘片，如有感染可見(jiàn)中性粒細(xì)胞。

Fig.1 Pictures showing typical adenocarcinoma from ROSE cytological slides圖1 典型肺腺癌ROSE細(xì)胞學(xué)制片在光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)

Fig.2 Pictures showing typical spuamous cell carcinoma from ROSE cytological slides圖2 典型肺鱗狀細(xì)胞癌ROSE細(xì)胞學(xué)制片在光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)

2.2 組織學(xué)標(biāo)本與配對(duì)ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本基因突變一致性分析 75例患者中36例在組織學(xué)標(biāo)本和配對(duì)ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)出了相同的EGFR突變類(lèi)型：23例 L858R突變，11例E746_A7501缺失，1例 L861Q突變，1例L747_P735突變，EGFR突變檢出一致率為100%。6例在組織學(xué)標(biāo)本配對(duì)ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)出了相同的KRAS突變類(lèi)型：4例G12V突變，2例G12C突變；1例在組織學(xué)標(biāo)本中檢測(cè)出KRAS突變（G12V突變），而在配對(duì)的ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中沒(méi)有檢測(cè)出KRAS突變，ROSE細(xì)胞學(xué)敏感度85.7%，特異度100%，一致率98.7%，見(jiàn)表1；1例在組織學(xué)標(biāo)本配對(duì)ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)出了相同的PIK3CA突變類(lèi)型（E545K突變）。

2.3 ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系 在組織學(xué)標(biāo)本配對(duì)ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)出了相同的EGFR突變類(lèi)型的36例中，EGFR基因突變高發(fā)于女性、非吸煙者和肺腺癌者（均P＜0.05），見(jiàn)表 2。

Tab.2 EGFR mutation and clinical characteristics in ROSE cytology group表2ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系例（%）

3 討論

隨著基因檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的獲取對(duì)于肺癌患者具有越來(lái)越重要的意義，因?yàn)榧?xì)胞學(xué)標(biāo)本獲取簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小，特別是對(duì)已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)的晚期肺癌患者，獲取腫瘤組織的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可以避免外科手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、減輕患者痛苦。已有學(xué)者對(duì)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本比如肺泡灌洗液、胸水、外周血、針吸細(xì)胞懸液等進(jìn)行基因突變檢測(cè)的報(bào)道［11-16］，但少有將ROSE細(xì)胞學(xué)制片作為細(xì)胞學(xué)標(biāo)本應(yīng)用于基因檢測(cè)的報(bào)道。在診斷性介入肺臟病學(xué)操作中，ROSE細(xì)胞學(xué)制片具有制作簡(jiǎn)單、制作所需時(shí)間短、易于保存、保存時(shí)間久等優(yōu)點(diǎn)，但其最主要的優(yōu)點(diǎn)是可以聯(lián)合快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)技術(shù)提供標(biāo)本細(xì)胞分類(lèi)和細(xì)胞數(shù)量的實(shí)時(shí)反饋。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地應(yīng)用NSCLC患者行氣管鏡檢查時(shí)現(xiàn)場(chǎng)制作的ROSE細(xì)胞學(xué)制片作為細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行EGFR、KRAS和PIK3CA基因突變檢測(cè)，對(duì)比配對(duì)的組織學(xué)標(biāo)本基因檢測(cè)的結(jié)果，探究ROSE細(xì)胞學(xué)制片作為細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行EGFR、KRAS和PIK3CA基因突變檢測(cè)的可行性。

本研究中，有1例組織學(xué)標(biāo)本檢測(cè)出KRAS基因突變而在ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中沒(méi)有檢出，筆者推測(cè)這1例ROSE細(xì)胞學(xué)制片基因突變檢測(cè)結(jié)果假陰性可能為ROSE細(xì)胞學(xué)制片上腫瘤細(xì)胞數(shù)量不足、刮取下來(lái)的腫瘤細(xì)胞中混雜有正常細(xì)胞（比如炎癥細(xì)胞、類(lèi)上皮細(xì)胞）導(dǎo)致。

常規(guī)的基因檢測(cè)方法如直接測(cè)序法、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）等技術(shù)由于敏感度不足等問(wèn)題在細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測(cè)基因突變應(yīng)用中受限，對(duì)于細(xì)胞數(shù)量確實(shí)很少的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，可以使用敏感性更高的檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)采用的xTAG70plex液相芯片技術(shù)有檢測(cè)樣本多樣性、所需樣本量少、敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快及檢測(cè)方便等優(yōu)勢(shì)［17］，但xTAG70plex液相芯片技術(shù)對(duì)于細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量尚無(wú)統(tǒng)一要求。Bozzetti等［18］指出當(dāng)使用直接測(cè)序法檢測(cè)基因突變時(shí)，吉姆薩染色制片上腫瘤細(xì)胞數(shù)量＞50%總細(xì)胞數(shù)量（即相當(dāng)于至少300個(gè)腫瘤細(xì)胞，DNA產(chǎn)量范圍為30～140 ng）判斷為細(xì)胞數(shù)量足夠用于 EGFR、KRAS 基因檢測(cè)。Jain 等［12］發(fā)現(xiàn)在DNA提取過(guò)程中將蛋白酶K孵育時(shí)間延長(zhǎng)至2 h可以提高DNA產(chǎn)量。目前關(guān)于細(xì)胞學(xué)標(biāo)本基因突變檢測(cè)腫瘤細(xì)胞數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)較少。為了避免分子檢測(cè)假陰性結(jié)果，應(yīng)取得盡可能多的腫瘤細(xì)胞。這就需要支氣管鏡操作者對(duì)腫瘤的準(zhǔn)確定位，除了支氣管鏡下直接可見(jiàn)的腫物外，還需要聯(lián)合采用支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)（EBUS）、磁導(dǎo)航、電子虛擬導(dǎo)航或者超聲探頭等輔助方法以幫助操作者準(zhǔn)確到達(dá)病灶取材，以取到盡可能多的腫瘤組織。另外，制作出高質(zhì)量的ROSE細(xì)胞學(xué)制片以保留盡可能多的腫瘤細(xì)胞也很重要，比如涂片應(yīng)厚薄均勻以減少細(xì)胞重疊、涂片經(jīng)空氣晾干后應(yīng)盡快放入染缸中染色以防止細(xì)胞溶解、及時(shí)更換染液以達(dá)到良好的染色效果等，而且良好的制片也有助于細(xì)胞病理學(xué)家對(duì)制片的判讀以指導(dǎo)氣管鏡準(zhǔn)確取材。

另外ROSE細(xì)胞學(xué)制片可以“一片兩用”，在一些特殊的情況下，患者行氣管鏡檢查取材時(shí)，鉗夾或穿刺病灶時(shí)大量出血或其他特殊情況不能繼續(xù)取材（例如出血風(fēng)險(xiǎn)極高、存在氣胸風(fēng)險(xiǎn)、患者極度不配合要求終止操作等）而無(wú)法取到足夠的組織標(biāo)本用于病理學(xué)診斷和基因檢測(cè)時(shí)，獲取的少量組織學(xué)標(biāo)本可以用于制作ROSE細(xì)胞學(xué)制片，繼而送檢細(xì)胞病理學(xué)診斷，用于診斷的ROSE細(xì)胞學(xué)制片在細(xì)胞病理學(xué)診斷后可以嘗試?yán)^續(xù)用于基因檢測(cè)，患者不僅可以避免再次行活檢取材的風(fēng)險(xiǎn)，也能盡快得到疾病的診斷和及時(shí)的治療。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者EGFR基因突變高發(fā)于女性、非吸煙、肺腺癌患者，且這類(lèi)NSCLC患者對(duì)靶向藥物吉非替尼反應(yīng)較好［12，16，19］，本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)在ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中，EGFR基因突變?cè)谂?、肺腺癌和非吸煙者中檢出率較高。

xTAG70plex液相芯片技術(shù)可以有效地檢測(cè)ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本EGFR、KRAS和PIK3CA的基因突變狀態(tài)，xTAG70plex液相芯片技術(shù)檢測(cè)ROSE細(xì)胞學(xué)標(biāo)本和配對(duì)的組織學(xué)標(biāo)本基因突變結(jié)果高度一致。因此，對(duì)于NSCLC患者，ROSE細(xì)胞學(xué)制片可以作為組織學(xué)替代標(biāo)本進(jìn)行基因檢測(cè)，并且此方法特別適用于沒(méi)有多余組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行基因檢測(cè)的晚期NSCLC患者，具有較高的臨床價(jià)值。

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