干擾SET8抑制血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)分化的研究

張東雪，高少輝，李同妙，周薇

血管鈣化是導(dǎo)致心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）發(fā)病率與死亡率升高的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和獨立危險因素［1］。血管鈣化不是一個被動的過程，而是由細胞介導(dǎo)的高度可調(diào)的過程［2］，其重要機制是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的成骨樣表型轉(zhuǎn)化。賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET8是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)唯一能夠特異性單甲基化組蛋白H4賴氨酸第 20位賴氨酸（histone H4 lysine 20，H4K20）的甲基轉(zhuǎn)移酶，參與調(diào)控細胞增殖、凋亡、細胞轉(zhuǎn)移與分化等［3］。SET8 還可甲基化 TWIST、Wnt、P53等非組蛋白［4］，并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程影響相應(yīng)基因的表達，進而調(diào)節(jié)細胞的轉(zhuǎn)移與分化等。也有研究表明活化的Wnt信號通路可通過上調(diào)RUNX2的表達進而促進血管鈣化［5］。但SET8在VSMCs轉(zhuǎn)分化中的作用尚少見相關(guān)研究。為此，本研究以大鼠VSMCs為模型，觀察SET8對大鼠VSMCs向成骨樣細胞分化的影響。

Tab.1 Primer sequence of each purpose gene表1 各目的基因引物序列

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供的清潔級健康雄性SD大鼠8只（合格證編號：1305090），均為4周齡，體質(zhì)量 80～120 g，平均體質(zhì)量（95.7±6.5）g。

1.2 實驗試劑及儀器 胎牛血清（fetal bovineserum，F(xiàn)BS）和DMEM（dulbecco’s modified eagle’s medium）培養(yǎng)基由美國GIBCO公司提供，SET8-短發(fā)夾RNA（shRNA）質(zhì)粒及空質(zhì)粒（NS-shRNA，廣州復(fù)能基因有限公司），LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），堿性磷酸酶（ALP）活性試劑盒（中國Njjcbio公司），反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（美國Thermo公司），PCR引物（上海捷瑞生物工程有限公司），RUNX2抗體和SET8抗體（英國Abcam公司），GAPDH抗體（美國Bioworld公司）。細胞培養(yǎng)箱（美國Sheldon公司），RT-PCR儀（美國Abi公司），倒置相差熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），酶標儀（美國Biotek公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Proteinsimple公司），蛋白電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.3 實驗?zāi)Ｐ偷闹苽渑c分組 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代大鼠胸主動脈VSMCs，具體操作為：采用2%戊巴比妥鈉進行麻醉，75%乙醇浸泡，于生物安全柜中分離出胸主動脈，剝除內(nèi)外膜，將中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，均勻鋪滿瓶底，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后更換新鮮培養(yǎng)基。之后每隔2 d換液，細胞融合80%～90%時進行傳代。細胞傳代培養(yǎng)至第3～4代時用于細胞實驗。將細胞接種于適宜孔板中，融合率達80%時給予轉(zhuǎn)染干預(yù)。轉(zhuǎn)染方法為：參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達。實驗分組為：（1）正常對照組：未轉(zhuǎn)染組。（2）空質(zhì)粒組：NS-shRNA質(zhì)粒濃度為2μg/L、Lipo2000 為 4 μL/孔，轉(zhuǎn)染 VSMCs。（3）SET8-shRNA 組：SET8-shRNA 質(zhì)粒濃度為 2μg/L、Lipo2000為 4μL/孔，轉(zhuǎn)染VSMCs。

1.4 RT-PCR測定VSMCs內(nèi)SET8、RUNX2 mRNA的表達水平 采用RNA提取試劑提取轉(zhuǎn)染后3組的mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。測定各組SET8與RUNX2的mRNA表達。實驗重復(fù)3次。以各組cDNA為模板，GAPDH作為內(nèi)參照。PCR引物由Primer 5.0軟件設(shè)計，見表1。反應(yīng)條件：GAPDH條件為95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)28次，繼續(xù)72℃延伸10 min。RUNX2條件為95℃變性 30 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 40 s，循環(huán) 30次，繼續(xù)72℃延伸10 min。SET8條件為95℃變性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸40 s，循環(huán)38次，繼續(xù)72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳后，采集圖像進行分析。

1.5 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測VSMCs內(nèi)SET8、RUNX2蛋白的表達 采用蛋白提取試劑提取轉(zhuǎn)染后3組的細胞總蛋白。應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度，煮沸變性后按每

孔總蛋白50μg加樣，采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，電泳條件為95 V電泳1.5 h。之后用干轉(zhuǎn)儀進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間為0.5 h。后放入5%的脫脂奶粉中于37℃恒溫箱中封閉2 h。一抗4℃孵育過夜，一抗稀釋比例分別為（GAPDH 1∶10 000，RUNX2 1∶500，SET8 1∶500）。次日洗膜，放入鼠二抗中（二抗稀釋比例為1∶10 000），室溫搖床孵育1 h，ECL顯色并應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像進行分析。實驗重復(fù)3次。

1.6 ALP活性測定 細胞轉(zhuǎn)染干預(yù)7 d后棄上清液，用PBS緩沖液洗2次，加適量質(zhì)量濃度1%的TritonX?100溶液，4℃冰箱靜置24 h，反復(fù)吹打細胞使其充分裂解，離心后棄沉淀物取上清液，按照ALP活性試劑盒說明書進行操作，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法于酶標儀520 nm波長處測定ALP的吸光度值，同時提取胞質(zhì)蛋白，應(yīng)用BCA法測定蛋白質(zhì)的含量，用以校正ALP的活性（U/mg）。實驗均重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SET8-shRNA對VSMCs SET8 mRNA和蛋白表達的影響 SET8-shRNA轉(zhuǎn)染VSMCs 48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率為50%。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，SET8-shRNA組VSMCs細胞中SET8 mRNA和蛋白的表達水平均低于正常對照組和空質(zhì)粒組（均P＜0.05），正常對照組與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計學意義，見圖1。

2.2 SET8-shRNA對VSMCs RUNX2 mRNA和蛋白表達的影響 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，SET8-shRNA組RUNX2 mRNA和蛋白的相對表達量均低于正常對照組和空質(zhì)粒組（均P＜0.05），正常對照組與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計學意義，見圖2。

2.3 SET8-shRNA對VSMCs ALP活性的影響 與正常對照組和空質(zhì)粒組比較，SET8-shRNA組ALP活性顯著降低（均P＜0.05），正常對照組與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計學意義，見圖3。

Fig.1 The influence of SET8-shRNA on VSMCs of SET8 expression圖1 SET8-shRNA對VSMCs SET8表達的影響

Fig.2 The influence of SET8-shRNA of RUNX2expression on the VSMCs圖2SET8-shRNA對VSMCs RUNX2表達的影響

Fig.3 The changes of alkaline phosphatase activity in VSMCs圖3 VSMCs各組ALP活性的變化

3 討論

血管鈣化在心血管疾病患者中普遍存在，主要表現(xiàn)在中膜鈣化，且與心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)，而VSMCs是血管中膜的主要組成成分，是血管中膜發(fā)生鈣化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［6-7］。VSMCs向成骨樣轉(zhuǎn)化是血管鈣化的重要機制之一［8］。Quarles［2］研究發(fā)現(xiàn)，中膜鈣化是一個主動的、受細胞和基因調(diào)控的、似成骨形成的過程，其特性為成骨樣分化。因此，抑制VSMCs的轉(zhuǎn)分化是減少血管鈣化的關(guān)鍵。SET8在腫瘤中發(fā)現(xiàn)具有促進上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用［9］。鑒于此，本研究通過干擾大鼠VSMCs SET8的基因表達，發(fā)現(xiàn)SET8可明顯抑制大鼠VSMCs RUNX2 mRNA和蛋白的表達，提示SET8可能參與了大鼠VSMCs向成骨樣細胞轉(zhuǎn)分化的過程。

Linscott等［10］研究發(fā)現(xiàn) SET8 能夠特異性單甲基化組蛋白H4K20，能招募特異的調(diào)節(jié)蛋白，在細胞內(nèi)具有調(diào)控組蛋白修飾、調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細胞周期等作用，其主要參與細胞增殖、細胞轉(zhuǎn)移分化等多種細胞生理功能。RUNX2是轉(zhuǎn)錄因子runt家族成員之一，是調(diào)控間充質(zhì)干細胞向成骨、軟骨轉(zhuǎn)化所必需的核心轉(zhuǎn)錄因子，在細胞的表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用［11］。有研究表明SET8作為共刺激因子參與了Wnt調(diào)控靶蛋白RUNX2表達的作用，進而調(diào)節(jié)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化［12-14］。為了證實SET8是否與VSMCs的表型轉(zhuǎn)化直接相關(guān)，本研究通過對 VSMCs進行轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（NS-shRNA）和SET8-shRNA質(zhì)粒，結(jié)果顯示正常對照組與空質(zhì)粒組比較RUNX2表達水平無明顯變化，說明VSMCs轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對RUNX2表達無明顯影響。而SET8-shRNA組RUNX2表達水平均顯著低于正常對照組和空質(zhì)粒組，提示干擾SET8基因表達可抑制VSMCs向成骨、成軟骨細胞表型轉(zhuǎn)化。ALP活性與成骨細胞的活性及成骨作用有關(guān)，也是VSMCs表型轉(zhuǎn)化的早期指標［15］。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組和空質(zhì)粒組比較，SET8-shRNA組ALP活性顯著降低，正常對照組與空質(zhì)粒組無明顯差異，進一步提示干擾SET8基因表達可抑制VSMCs向成骨、成軟骨細胞表型轉(zhuǎn)化。

綜上所述，SET8-shRNA可有效抑制VSMCs中SET8的表達。干擾SET8基因表達可有效降低大鼠VSMCs RUNX2表達水平以及ALP活性，進而抑制其表型轉(zhuǎn)化。本研究僅在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)了干擾SET8可抑制VSMCs向成骨、成軟骨細胞表型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，其影響VSMCs表型轉(zhuǎn)化的具體機制仍需進一步研究驗證。

［1］Lanzer P，Boehm M，Sorribas V，et al.Medial vascular calcification revisited：review and perspectives［J］.Eur Heart J，2014，35（23）：1515-1525.doi：10.1093/eurheartj/ehu163.

［2］Quarles LD.Reducing cardiovascular mortality in chronic kidney disease：something borrowed，something new［J］.J Clin Invest，2013，123（2）：542-543.doi：10.1172/JCI67203.

［3］徐金升，王靜，張俊霞，等.賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET8基因沉默通過Wnt信號通路抑制腎透明細胞癌786-O細胞增殖轉(zhuǎn)移［J］.中華實驗外科雜志，2016，33（6）：1684-1685.Xu JS，Wang J，Zhang JX，et al.Lysine methyltransferase SET8 silencing inhibits cell growth and migration of renal cell carcinoma through Wnt signaling pathway［J］.Chin J Exp Surg，2016，33（6）：1684-1685.doi：10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2016.06.082.

［4］劉奔，張熙凝，陳可欣.組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET8對蛋白的甲基化修飾及與腫瘤相關(guān)性的研究進展［J］.中國腫瘤臨床，2015，42（15）：765-769.Liu B，Zhang XN，Chen KX.Research progress on histone lysine methyltransferase SET8 in methylation modification and association with tumor［J］.Chin J Clin Oncol，2015，42（15）：765-769.doi：10.3969/j.issn.1000-8179.20150553.

［5］Herencia C，Rodriguez-Ortiz ME，Mu?oz-Casta?eda JR，et al.AngiotensinⅡprevents calcification in vascular smooth muscle cells by enhancing magnesium influx［J］.Eur J Clin Invest，2015，45（11）：1129-1144.doi：10.1111/eci.12517.

［6］Bai Y，Zhang J，Xu J，et al.Alteration of type I collagen in theradial artery of patients with end-stage renal disease［J］.Am J Med Sci， 2015， 349 （4） ： 292-297.doi： 10.1097/MAJ.0000000000000408.

［7］Nitta K，Ogawa T.Vascular calcification in end-stage renal disease patients［J］.Contrib Nephro，2015，185：156-167.doi：10.1159/000380980.

［8］Moe OW，Kuro OM.Fibroblast growth factor 23 and uremic vascular calcification：is it time to escalate from biomarker status to pathogenic agent［J］.Kidney Int，2014，85（5）：1022-1023.doi：10.1038/ki.2013.471.

［9］Yang F，Sun L，Li Q，et al.SET8 promotes epithelial-mesenchymal transition and confers TWIST dual transcriptional activities［J］.EMBO J，2012，31（1）：110-123.doi：10.1038/emboj.2011.364.

［10］Linscott J，Kapilashrami K，Wang Z，et al.Kinetic isotope effects reveal early transition state of protein lysine methyltransferase SET8［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2016，113（52）：E8369-E8378.doi：10.1073/pnas.1609032114.

［11］Zhou Y，Wang JY，F(xiàn)ang H，et al.Overexpression of clq/tumor necrosis factor-related protein-3 promotes phosphate-induced vascular smooth muscle cell ealcifieation bothin vivoandin vitro［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34（5）：1002-1010.

［12］徐金升，王靜，張俊霞，等.SET8在腎透明細胞癌中的表達及其對786-0細胞增殖遷移能力的影響［J］.中華泌尿外科雜志，2016，37（11）：860-865.Xu JS，Wang J，Zhang JX，et al.Expression of SET in renal cell carcinoma and the effects of SET8 silencing on proliferation and migration of 786-0 cells［J］.Chin J Urol，2016，37（11）：860-865.doi：10.3760/cma.j.issn.1000-6702.2016.11.018.

［13］Hou L，Li Q，Yu Y，et al.SET8 induces epithelial-mesenchymal transition and enhances prostate cancercellmetastasis by cooperating with ZEB1［J］.Mol Med Rep，2016，13（2）：1681-1688.doi：10.3892/mmr.2015.4733.

［14］Chen T，Mao H，Chen C，et al.The role and mechanism of α-Klotho in the calcification of rat aortic vascular smooth muscle cells［J］.Biomed Res Int，2015，2015：194362.doi：10.1155/2015/194362.

［15］Lee GH，Kim HR，Chae HJ.BI?1 enhances Fas?induced cell death through a Na+/H+ ?associated mechanism［J］.BMB Rep，2014，47（7）：393?398.doi：10.5483/BMBRep.2014.47.7.194.