TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶及CarO 蛋白介導(dǎo)的耐舒巴坦鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株耐藥機(jī)制研究

李楠，張豪杰，王悅，祁萌，郭文學(xué)，王哲，祁偉

鮑曼不動(dòng)桿菌屬非發(fā)酵糖的革蘭陰性桿菌，是醫(yī)院感染的重要條件致病菌之一，可引起廣泛的院內(nèi)感染，包括尿路感染、術(shù)后感染、菌血癥、腦膜炎及呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎等［1］。該菌耐藥嚴(yán)重，2000年后，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率迅速上升，臨床上常將舒巴坦作為治療耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的重要藥物之一［2-3］。然而，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)舒巴坦的耐藥率也在逐年增加［4-5］，這無(wú)疑進(jìn)一步加大了抗感染治療難度。TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶及CarO蛋白是介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)舒巴坦耐藥的重要機(jī)制，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶編碼基因blaTEM-1及carO基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，探討TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶及CarO蛋白在耐舒巴坦鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株中所起作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源及分組 篩選來(lái)自2013年1月—2015年6月天津市某三甲綜合醫(yī)院患者呼吸道、尿道分離出的鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株24株。全部臨床株經(jīng)生化鑒定。通過(guò)藥敏試驗(yàn)分為舒巴坦非敏感組（耐藥12株，中介6株）和敏感組（6株）。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司），DYY-6D型電泳儀（北京六一儀器廠），Line-gene Real-Time PCR Detection System（杭州博日科技有限公司），GEL-DOC-200型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）。抗生素藥敏紙片購(gòu)自天津市金章科技有限公司；舒巴坦鈉（SUL）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于中國(guó)食品藥品檢定研究院。DNA聚合酶、引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。EASY spin Plus細(xì)菌RNA快速提取試劑盒（PN43）購(gòu)自中國(guó)北京艾德萊生物科技有限公司；焦磷酸二乙酯（DEPC）購(gòu)自 BBI公司。Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（k1622）購(gòu)自Thermo科技有限公司，BioEasy Master Mix（SYBR Green）購(gòu)自博日科技有限公司?；驕y(cè)序委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 體外藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂稀釋法測(cè)定菌株對(duì)舒巴坦鈉標(biāo)準(zhǔn)品的最低抑菌濃度（MIC）。折點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［6］，≤4 mg/L 為敏感（S），8 mg/L 為中介（I），≥16 mg/L為耐藥（R）。采用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer，K-B）測(cè)定菌株對(duì)頭孢哌酮（CFP）、美羅培南（MEM）、亞胺培南（IMP）、環(huán)丙沙星（CIP）、慶大霉素（GEN）、氨芐西林（AMP）等藥物的敏感性。依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLIS）2016年頒布的準(zhǔn)則判讀。質(zhì)控菌株為ATCC29522和ATCC27853。

1.2.2 基因擴(kuò)增 細(xì)菌總DNA提取采用煮沸法。BlaTEM-1基因引物參考文獻(xiàn)［7］，carO基因引物使用Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min；變性 94 ℃ 60 s，退火 50 ℃ 60 s，延伸 72 ℃ 60 s，32 個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸8 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，GEL-DOC-200凝膠成像系統(tǒng)照相觀察結(jié)果。挑選4株blaTEM-1陽(yáng)性菌株（A3、A5、1327、C1），對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)BLAST軟件比對(duì)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 細(xì)菌總RNA提取、cDNA合成、RT-PCR反應(yīng)均按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RT-PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃1 min；變性95℃15 s，退火60℃15 s，延伸72℃30 s，30個(gè)循環(huán)。BlaTEM-1基因引物使用Primer 5.0自行設(shè)計(jì)，carO基因、內(nèi)參基因rpoB引物參考文獻(xiàn)［8-9］。引物序列見(jiàn)表 1。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 carO 及 blaTEM-1mRNA相對(duì)表達(dá)量。每株菌株重復(fù)檢測(cè)3次，取均值。

Tab.1 The sequence of primer表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。不符合正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（Q）］表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 24株鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株不同組別對(duì)6種常用抗生素藥敏結(jié)果、對(duì)舒巴坦的MIC值及判定結(jié)果見(jiàn)表2、3。

Tab.2 The results of drug susceptibility表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2 基因擴(kuò)增結(jié)果 非敏感組中除B1、B2外全部攜帶blaTEM-1基因，敏感菌株均未檢測(cè)到blaTEM-1基因，見(jiàn)圖1；24株鮑曼不動(dòng)桿菌全部擴(kuò)增出carO基因，見(jiàn)圖 2。選取的 A3、A5、1327、C1 臨床株，其blaTEM-1基因序列與 GenBank中給出 blaTEM-1基因（JQ670906）同源性為99%，經(jīng)Blastx比對(duì)，未出現(xiàn)氨基酸替代，見(jiàn)圖3。經(jīng)BLAST軟件分析測(cè)序結(jié)果，C1 啟動(dòng)子為 P3，A3、A5、1327 啟動(dòng)序列-10 區(qū)第162位堿基由G→T，突變?yōu)镻4啟動(dòng)子。

Tab.3 The MIC values of sulbactam and the mRNA expression levels of blaTEM-1and carO genes表3 舒巴坦的MIC值及blaTEM-1、carO基因mRNA表達(dá)

Fig.1 PCR amplification of blaTEM-1gene圖1 blaTEM-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.2 PCR amplification of carO gene圖2 carO基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.3 The Blastx comparison of blaTEM-1gene clinical strains of A3,A5,1327 and C1圖3 A3、A5、1327、C1臨床株blaTEM-1Blastx比對(duì)圖

2.3 RT-PCR結(jié)果 基因擴(kuò)增熔解曲線為單峰，見(jiàn)圖 4、5，為特異性擴(kuò)增，carO及blaTEM-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果，見(jiàn)表3。16株blaTEM-1陽(yáng)性菌株blaTEM-1基因 mRNA 表達(dá)波動(dòng)于 0.323～6.761，M（Q）為 1.067（0.644），舒巴坦 MIC 波動(dòng)于 8～64 mg/L，M（Q）為 32（56）；16株 blaTEM-1陽(yáng)性菌株舒巴坦 MIC 值與blaTEM-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量呈中度正相關(guān)（rs=0.551，P=0.027）。非敏感組carO基因mRNA相對(duì)表達(dá)量波動(dòng)于 0.253～10.360，M（Q）為 1.216（1.133），敏感組臨床株carO基因mRNA相對(duì)表達(dá)量波動(dòng)于0.410～3.125，M（Q）為 0.983（3.344），2 組間 carO 基因mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.167，P=0.868）。

Fig.4 Melting curve of carO gene圖4 carO基因熔解曲線

Fig.5 Melting curve of blaTEM-1gene圖5 blaTEM-1基因熔解曲線

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染常見(jiàn)的病原菌，耐藥嚴(yán)重。2005—2014年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌在大型三甲醫(yī)院的分離率逐漸升高，且對(duì)青霉素、頭孢菌素類普遍耐藥，2014年對(duì)碳青霉烯類耐藥率達(dá)60%以上，但是對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素、頭孢哌酮/舒巴坦有較好的敏感性［4］。湖南湘雅醫(yī)院2015年鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢曲松、亞胺培南耐藥率均達(dá)80%以上［10］。羅馬尼亞有報(bào)道，鮑曼不動(dòng)桿菌感染后抗生素治療失敗率僅次于銅綠假單胞菌［11］。本研究中鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株耐藥嚴(yán)重，但是對(duì)碳青霉烯類耐藥率低于上述報(bào)道，而對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素耐藥性高于上述報(bào)道，這可能與當(dāng)?shù)乜股厥褂锰攸c(diǎn)有關(guān)；其次本研究樣本量較小，且菌株經(jīng)過(guò)篩選，缺乏代表性。但是，6株敏感菌株中5株對(duì)頭孢哌酮或氨芐西林耐藥，2株對(duì)碳青霉烯類耐藥，這顯示了當(dāng)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)普通β-內(nèi)酰胺甚至碳青霉烯類藥物耐藥時(shí)，對(duì)舒巴坦可能仍有較好的敏感性，這支持臨床上應(yīng)用舒巴坦治療多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌［2-3］。然而，鮑曼不動(dòng)桿菌舒巴坦的敏感性逐年下降，其耐藥機(jī)制也成為研究熱點(diǎn)。

產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是大多數(shù)細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素主要耐藥機(jī)制之一。TEM-1是革蘭陰性菌中最常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺酶，不僅導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，甚至參與細(xì)菌對(duì)含酶抑制劑的復(fù)合物的耐藥機(jī)制。早在1995年，Joly-Guillou等［12］報(bào)道產(chǎn)TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)舒巴坦的MIC值較不產(chǎn)者高。本研究6株敏感株blaTEM-1均陰性，18株非敏感株中16株blaTEM-1陽(yáng)性，且blaTEM-1陽(yáng)性菌株的舒巴坦MIC值與blaTEM-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量呈中度正相關(guān)，提示鮑曼不動(dòng)桿菌TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)越高其對(duì)舒巴坦的MIC值越高，與以往研究結(jié)果相似［6］。這可能與舒巴坦和β-內(nèi)酰胺酶間的作用機(jī)制有關(guān)。TEM-1的絲氨酸活性中心位于ɑ螺旋H2的N端，其邊緣為一氧負(fù)離子穴，舒巴坦靠氧負(fù)離子穴和Arg244的吸引作用與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合，然后酶的絲氨酸活性基團(tuán)攻擊舒巴坦內(nèi)酰胺環(huán)的羧基碳，舒巴坦的五元環(huán)被打開(kāi)，在此過(guò)程中，舒巴坦被消耗［13-15］。然而，本研究中還發(fā)現(xiàn)2株對(duì)舒巴坦耐藥但是blaTEM-1陰性菌株，這可能與鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，可能存在本研究未涉及的耐藥機(jī)制有關(guān)，如青霉素結(jié)合蛋白表達(dá)減低或變異，可導(dǎo)致舒巴坦不能與鮑曼不動(dòng)桿菌的青霉素蛋白結(jié)合或結(jié)合力減低［16］，或產(chǎn)生頭孢菌素酶-30［17］等，從而不能對(duì)其起殺菌作用。

BlaTEM-1基因表達(dá)受多種機(jī)制調(diào)控，其中啟動(dòng)子調(diào)控為重要機(jī)制之一。國(guó)外學(xué)者曾報(bào)道blaTEM-1型基因啟動(dòng)子主要有 P3、Pa/Pb、P4、P5四型，其中 P3為弱啟動(dòng)子，Pa/Pb、P4、P5 為強(qiáng)啟動(dòng)子［18］。本實(shí)驗(yàn)中攜帶強(qiáng)啟動(dòng)子菌株blaTEM-1mRNA表達(dá)均高于攜帶弱啟動(dòng)子菌株，與文獻(xiàn)［6，18］研究結(jié)果相似，提示啟動(dòng)子可能是介導(dǎo)blaTEM-1mRNA高表達(dá)的機(jī)制之一。在blaTEM-1基因的基礎(chǔ)上發(fā)生一個(gè)或數(shù)個(gè)點(diǎn)突變，可突變成為編碼耐酶抑制劑（inhibitor-resistant TEM，IRT）的基因。IRT不受酶抑制劑影響，是細(xì)菌對(duì)含酶抑制劑復(fù)合物抗生素（主要是阿莫西林/克拉維酸）耐藥的重要原因。但I(xiàn)RT介導(dǎo)的耐藥機(jī)制主要在歐洲報(bào)道［19］，我國(guó)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究4株測(cè)序菌株，也未發(fā)現(xiàn)IRT，考慮blaTEM-1基因突變?cè)邗U曼不動(dòng)桿菌對(duì)舒巴坦耐藥機(jī)制中少見(jiàn)。

CarO蛋白作為通道蛋白，可攝取小分子水溶性物質(zhì)，如亞胺培南、鳥(niǎo)氨酸、絲氨酸及賴氨酸等［20］。而舒巴坦作為水溶性小分子物質(zhì)，理論上可以通過(guò)CarO通道。本研究發(fā)現(xiàn)carO基因mRNA相對(duì)表達(dá)量在非敏感組與敏感組間表達(dá)無(wú)差異，與吳萌萌等［21］報(bào)道結(jié)果不同?；虮磉_(dá)和翻譯水平也受多種機(jī)制調(diào)節(jié)，CarO蛋白表達(dá)是否參與鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)舒巴坦耐藥機(jī)制，還需做進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究中鮑曼不動(dòng)桿菌臨床受試株耐藥嚴(yán)重，其對(duì)舒巴坦的主要耐藥機(jī)制與TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶高表達(dá)有關(guān)，而啟動(dòng)子調(diào)控可能是blaTEM-1基因mRNA高表達(dá)的原因之一。

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