5-氮雜-2′-脫氧胞苷對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Hs578T 增殖和PRDM10基因甲基化的影響

張曉宇，白杰，康曉寧，靳麗君，王鵬，劉偉，王遵義△

乳腺癌是一種發(fā)病率和死亡率均很高的惡性腫瘤，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2025年將超過1 900萬例的癌癥被確診為乳腺癌［1］。腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出的無序、無限制惡性增殖，以及肺、腦及骨等全身重要臟器的轉(zhuǎn)移，都將直接威脅人類的生命健康。通常認(rèn)為乳腺癌是乳腺上皮細(xì)胞在多種致癌因子作用下發(fā)生了基因突變，致使細(xì)胞增殖失控。約5%～10%的乳腺癌患者有家族聚集的特點(diǎn)［2-3］。80%～85%具有易感基因突變的女性罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不具有易感基因突變的女性［4-5］。

PRDM 蛋白（PR domain zinc finger protein）是一個(gè)氨基端含有保守的PR同源區(qū)（簡稱PR區(qū)）的鋅指蛋白家族［6-7］。PRDM是Ca2+依賴磷脂結(jié)合蛋白，在機(jī)體的許多生理及病理過程中起重要作用，可調(diào)控細(xì)胞完整性、細(xì)胞分化、生長及凋亡，還可抑制腫瘤細(xì)胞的生長等。PRDM與腫瘤關(guān)系密切，其基因啟動(dòng)子甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前PRDM家族基因的研究主要集中于肺癌、前列腺癌、腎癌和淋巴瘤，涉及乳腺癌的研究較少。經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑等處理后，因基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化而失活的基因可以恢復(fù)mRNA的轉(zhuǎn)錄而重新表達(dá)。5-氮雜-2′-脫氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR）是一種最常用的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，其作用機(jī)制是通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)結(jié)合，降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的生物活性，從而降低甲基化水平。本研究采用不同濃度5-Aza-CdR處理乳腺癌細(xì)胞Hs578T，探究PRDM10基因甲基化對(duì)乳腺癌細(xì)胞Hs578T增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系Hs578T購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，由河北省滄州市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。Hs578T使用含有10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司），放置于37℃、5%CO2、95%空氣濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長，取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）溶液、二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）、5-Aza-CdR、Trizol均購自美國 Sigma公司。PRDM10抗體和羊抗兔IgG購自Affinity公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0試劑盒購自日本TaKaRa公司，EZ-DNA Methylation-Gold KitTMDNA甲基化修飾試劑盒購自美國Zymo公司，Access RT-PCR system試劑盒購自美國Promega公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海靜融生物科技有限公司。ELX800自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司，紫外凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，HIPAS-1000型圖像分析系統(tǒng)購自武漢華海公司，全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法測(cè)定5-Aza-cdR對(duì)Hs578T增殖的影響 Hs578T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，將2 000個(gè)細(xì)胞接種在96孔板的每個(gè)孔內(nèi)，加入100μL含血清培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)，共接種4塊板。24 h細(xì)胞完全貼壁，分別用0（對(duì)照組）、1、3和5μmol/L 5-Aza-CdR處理細(xì)胞，調(diào)整每孔終體積為200μL，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別于處理24、48、72和96 h后測(cè)量細(xì)胞量，每孔加入5 g/L的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸凈培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，在搖床上輕柔搖勻，孵育1 h。待MTT結(jié)晶充分溶解，在ELX800自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取每個(gè)孔的光密度（OD）值（570 nm）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 MSP檢測(cè)PRDM10基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài) 采用甲基化特異性PCR法（Methylation-specific PCR，MSP）檢測(cè)5-Aza-CdR對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Hs578T中PRDM10基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的影響。分別收集0（對(duì)照組）、1、3和5μmol/L 5-Aza-CdR處理72 h的人乳腺癌細(xì)胞Hs578T，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。采用Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0試劑盒提取基因組DNA。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性后，采用EZ-DNA Methylation-Gold KitTMDNA甲基化修飾試劑盒進(jìn)行DNA甲基化修飾。擴(kuò)增引物采用MethyPrimer軟件（http：//www.urogene.org/cgibin/methprimer/methprimer.cgi）設(shè)計(jì)，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PRDM10甲基化（PRDM10-M）的引物序列：上游 5′-TGGTTTTTTTGTAGATTGAATAAGC-3′，下游 5′-TAAACTCTATAAACCCCATACCGTA-3′，擴(kuò)增片段120 bp。PRDM10未甲基化（PRDM10-UM）的引物序列：上游 5′-TGGTTTTTTTGTAGATTGAATAAGC-3′，下游 5′-TAAACTCTATAAACCCCATACCGTA-3′，擴(kuò)增片段 118 bp。反應(yīng)體系 50μL，包括去離子水 16μL、2×Taq Master Mix 25μL、DNA模板3μL、濃度為10μmol/L的上、下游引物各3μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸60 s，共 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描采集圖像，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行OD值半定量測(cè)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)PRDM10的mRNA表達(dá)水平 將1×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板中，貼壁后分別用0（對(duì)照組）、1、3和5μmol/L 5-Aza-CdR處理細(xì)胞72 h，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴(kuò)增引物分別利用 Primer 3軟件（http：//primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PRDM10基因的引物序列：上游 5′-TGGCCCTGCTATGAATGTAAC-3′，下游5′-GGGATTGGGATAGTGGTCTGT-3′，擴(kuò)增片段 323 bp。參照Access RT-PCR system試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，50μL反應(yīng)體系添加0.1μg模板，上、下游引物的終濃度分別為1μmol/L。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，57℃退火60 s，72℃延伸 60 s，共 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸3 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描采集圖像，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行OD值半定量測(cè)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測(cè)PRDM10的蛋白表達(dá)水平 將1×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板，貼壁后分別用0（對(duì)照組）、1、3和5μmol/L 5-Aza-CdR處理細(xì)胞72 h，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。處理結(jié)束后收集并裂解細(xì)胞，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)總蛋白量。樣本經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（100 V恒壓）分離，然后按照凝膠面積以0.65 mA/cm2恒流電轉(zhuǎn)移1.5 h將蛋白自凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入1∶1 000稀釋的兔抗人PRDM10抗體，4℃孵育過夜，TBST漂洗后用1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗孵育1.5 h，漂洗后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒增強(qiáng)發(fā)光，X線膠片顯影。利用HIPAS-1000型圖像分析系統(tǒng)對(duì)X線膠片上的條帶進(jìn)行OD值測(cè)量。以β-actin蛋白作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。處理前后兩樣本均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)；不同時(shí)點(diǎn)多組間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Hs578T增殖的影響 （1）組間比較。24 h時(shí)，0、1、3、5 μmol/L 5-Aza-CdR組Hs578T的OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；48 h時(shí)，3、5μmol/L組 OD 值低于 0μmol/L組（P＜0.05）；72 h和 96 h時(shí)，1、3、5μmol/L 組均低于 0μmol/L，5μmol/L 組低于 1μmol/L（P＜0.05）。（2）組內(nèi)比較。0μmol/L組OD值隨時(shí)間逐漸增高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；1μmol/L組OD值 48、72、96 h 均高于 24 h，96 h 高于 48 h（P＜0.05）；3 μmol/L 組 OD 值 48、72、96 h 均高于 24 h，同時(shí) 96 h高于 48 h（P＜0.05）；5μmol/L組 OD 值不同時(shí)點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間和處理時(shí)間之間存在交互效應(yīng)（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of the cell growth after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR表1 不同濃度5-Aza-CdR處理細(xì)胞后細(xì)胞生長情況比較（n=5，±s）

Tab.1 Comparison of the cell growth after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR表1 不同濃度5-Aza-CdR處理細(xì)胞后細(xì)胞生長情況比較（n=5，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F 組間=10.087，F(xiàn) 時(shí)間 =165.117，F(xiàn) 交互=73.334，均 P＜0.05；組間比較：a與 0μmol/L 比較，b與 1μmol/L 比較，c與 3μmol/L 比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與 24 h 比較，B與 48 h 比較，C與72 h比較，P＜0.05

5-Aza-CdR濃度0μmol/L 1μmol/L 3μmol/L 5μmol/L F OD值24 h 0.43±0.21 0.43±0.13 0.44±0.14 0.43±0.12 0.001 48 h 0.71±0.14A 0.58±0.11A 0.49±0.14aA 0.42±0.13a 4.503＊72 h 0.96±0.18AB 0.62±0.11aA 0.52±0.11aA 0.42±0.12ab 14.886＊＊96 h 1.36±0.17ABC 0.67±0.15aAB 0.56±0.11aAB 0.42±0.15ab 40.543＊＊F 279.910＊＊35.033＊＊19.977＊＊0.043

2.2 5-Aza-CdR對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Hs578T中PRDM10基因甲基化的影響 （1）組間比較。處理前，0、1、3、5μmol/L 組 OD 值各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。處理后，0～5μmol/L組OD值逐漸降低，3μmol/L與5μmol/L組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）組內(nèi)比較。1、3、5μmol/L 組處理后顯著低于處理前（P＜0.05）見表 2、圖 1。

2.3 5-Aza-CdR對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Hs578TPRDM10表達(dá)的影響 RT-PCR和Western blot結(jié)果均顯示，不同濃度5-Aza-CdR處理細(xì)胞后，0～5μmol/L組人乳腺癌細(xì)胞Hs578TPRDM10mRNA和蛋白表達(dá)水平均逐漸升高，且組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 3、圖 2。

3 討論

DNA甲基化和組蛋白甲基化在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。有研究證實(shí)BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化能夠引起基因沉默，進(jìn)而增加機(jī)體對(duì)鉑類藥物的敏感性［8］。在乳腺癌組織中p16甲基化能夠引起基因沉默和蛋白表達(dá)降低［9］。有多種抑癌基因被證實(shí)在乳腺癌組織中發(fā)生不同程度的甲基化，例如GSTP1、PTEN、MGMT、RARβ2、p16INK4A和CCND2等［10-13］。Goebel等［14］采用甲基化和未甲基化的CpG處理人類乳腺癌細(xì)胞系BT-20和Hs578T，然后篩選差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)CHAC1mRNA表達(dá)升高可能是預(yù)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。以上研究說明基因甲基化在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后評(píng)價(jià)中具有重要意義，這也是筆者研究PRDM10基因在乳腺癌中作用的理論基礎(chǔ)。DNA甲基化可引起基因組中相應(yīng)區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，染色質(zhì)高度螺旋化，凝縮成團(tuán)，失去轉(zhuǎn)錄活性［15］。基因組中60%～90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地組成CpG島，位于結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。有研究表明，腫瘤抑制基因BRCA1的啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島被過度甲基化時(shí)，可以導(dǎo)致抑癌基因的轉(zhuǎn)錄沉默，進(jìn)而影響B(tài)RCA1參與散發(fā)性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程［16］。上述研究初步探討了基因甲基化和去甲基化在癌癥中的作用機(jī)制，為筆者通過去甲基化處理PRDM10基因進(jìn)而研究去甲基化試劑對(duì)乳腺癌增殖影響的相關(guān)機(jī)制提供了參考。去甲基化試劑5-Aza-CdR通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，降低DNA活性，使不同的抑癌基因得以開放，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)展［17］。本研究用不同濃度的5-Aza-CdR處理乳腺癌細(xì)胞Hs578T，進(jìn)而研究5-Aza-CdR對(duì)Hs578T的增殖以及PRDM10基因甲基化的影響。

Fig.1 The methylation levels of PRDM10 gene in Hs578T before and after treated with different concentrations of 5-Aza-CdR圖1 不同濃度5-Aza-CdR處理前后Hs578T中PRDM10基因甲基化水平

Tab.2 Comparsion of the methylation levels of PRDM10 before and after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR表2 不同濃度5-Aza-CdR處理細(xì)胞前后PRDM10的甲基化水平比較 （n=5，±s）

Tab.2 Comparsion of the methylation levels of PRDM10 before and after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR表2 不同濃度5-Aza-CdR處理細(xì)胞前后PRDM10的甲基化水平比較 （n=5，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與 0 μmol/L 比較，b與 1 μmol/L 比較，P＜0.05

5-Aza-CdR濃度0μmol/L 1μmol/L 3μmol/L 5μmol/L F OD值處理前27.45±3.87 25.94±2.74 28.93±2.65 29.86±3.69 1.369處理后27.80±3.05 16.41±4.26a 0.05±0.03ab 0.05±0.05ab 133.738＊＊t 0.245 4.354＊24.205＊＊18.231＊＊

Tab.3 Comparsion of the mRNA and protein levels of PRDM10 after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR表3 不同濃度5-Aza-CdR處理細(xì)胞后PRDM10的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 （n=5）

Fig.2 The mRNA and protein levels of PRDM10 gene in Hs578 after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR圖2 不同濃度5-Aza-CdR處理72 h后PRDM10 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

PRDM10是PRDM家族的一員，在關(guān)節(jié)滑膜組織中表達(dá)，與關(guān)節(jié)病的發(fā)病有關(guān)，可作為炎性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志物［18］。多形性未分化肉瘤中反復(fù)出現(xiàn)PRDM10基因融合，對(duì)其臨床分型具有重要作用［19］。目前尚少見PRDM10基因在其他乳腺癌細(xì)胞和乳腺組織中表達(dá)的報(bào)道。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，PRDM10的甲基化狀態(tài)與乳腺癌細(xì)胞增殖功能密切相關(guān)［20］，筆者進(jìn)一步研究了去甲基化試劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖功能以及PRDM10的甲基化狀態(tài)影響，發(fā)現(xiàn)PRDM10基因在乳腺癌細(xì)胞Hs578T中不表達(dá)，這可能是相關(guān)研究較少的原因之一。本研究通過甲基化水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PRDM10基因在Hs578T中處于完全甲基化，并且3μmol/L的5-Aza-CdR能夠使PRDM10基因甲基化狀態(tài)完全逆轉(zhuǎn)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去甲基化試劑5-Aza-CdR能夠明顯地抑制Hs578T細(xì)胞的生長，提示去甲基化藥物具有臨床開發(fā)潛力。此外，MTT實(shí)驗(yàn)還顯示，5-Aza-CdR的濃度越高、處理時(shí)間越長，對(duì)Hs578T細(xì)胞增殖的作用越顯著。但是如果濃度過低或者處理時(shí)間不夠長這種抑制作用不顯著。

綜上所述，5-Aza-CdR抑制人乳腺癌細(xì)胞Hs578T的增殖，可能與該細(xì)胞中PRDM10基因的去甲基化有關(guān)。

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