山藥提取物聯(lián)合替加氟對結腸癌HT-29細胞株體內外殺傷作用的研究

孫雯雯，宋林，李宏峰，范玉強

替加氟為氟尿嘧啶的衍生物，目前是治療惡性消化道腫瘤的常用化療藥物，但會對消化系統(tǒng)和血液系統(tǒng)等產生一系列的不良反應［1］。山藥能增加T淋巴細胞的活性，增強機體免疫力，抑制腫瘤細胞增殖，山藥提取物中山藥多糖具有較好地誘導肝癌、胃癌、結腸癌等腫瘤細胞凋亡、抑制血管新生、抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移、逆轉耐藥性、增強機體免疫力等多種抗癌作用［2-4］。本研究旨在探討山藥提取物與替加氟聯(lián)合使用對結腸癌的體內外殺傷效果。

1 材料與方法

1.1 材料 結腸癌HT-29細胞（美國ATCC?HTB-38TM）由天津市腫瘤醫(yī)院惠贈；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；0.25%胰酶消化液購自索萊寶公司；CD133磁珠抗體購自德國Miltenyi公司；MTT試劑盒購自瑞士Roche公司；一抗兔抗血管內皮生長因子（VEGF）抗體，山羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司；山藥飲片購自宛西制藥廠，生藥用8倍量的水提取3次，每次2 h，合并濾液，先經70℃旋蒸濃縮，后轉移至蒸發(fā)皿中于70℃真空至干，提取率為2.78%，提取物主要成分是多糖，多糖含量為（324.90±0.82）mg/g；替加氟購自辰欣藥業(yè)股份有限公司。實驗動物：SPF級BALB/c nude小鼠購自維通利華公司，動物合格證號為11400500018046，雌性，3～4周齡，40只，體質量 16～18 g，飼養(yǎng)于 IVC 系統(tǒng)內。

1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜（Thermo公司，美國）；顯微鏡（Olympus公司，日本）；流式細胞儀（BD公司，美國）；離心機（Eppendorf公司，德國）；磁珠分選器（Miltenyi公司，德國）；IVC系統(tǒng)主機（蘇州市蘇杭科技器材有限公司，中國）。

1.3 細胞毒實驗 取對數(shù)生長期HT-29細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成5×104個/mL單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入180μL。培養(yǎng)24 h后，加入受試藥物。實驗共分4組：（1）空白對照組，加入等體積含二甲基亞砜（DMSO）的生理鹽水。（2）山藥提取物組，調節(jié)終質量濃度為125 mg/L。（3）替加氟組，調節(jié)終質量濃度為36 mg/L。（4）聯(lián)合治療組，調節(jié)山藥提取物終質量濃度為125 mg/L，并且替加氟終質量濃度為36 mg/L。將平板在37℃、5%CO2的溫箱中孵育36 h，去除培養(yǎng)液。每孔加入含0.5 g/L MTT的PBS液100μL，37℃溫育36 h。棄去上清液，每孔加入100μL DMSO，置于全自動酶標儀490 nm處測定光密度（OD）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=（1-實驗組OD/對照組OD）×100%，實驗重復5次。

1.4 流式細胞儀檢測干細胞比例 取對數(shù)生長期HT-29細胞，用0.25%胰酶/0.2%EDTA消化液消化，觀察細胞變圓、連接消失后，用完全培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液吸入10 mL離心管，400×g，離心 5 min，棄去培養(yǎng)液，用 80μL緩沖液（0.5%BSA，2 mmol/L EDTA，0.01 mmol/L PBS）洗滌，重懸。加入20μL FC受體阻斷劑，加入鼠抗人CD133單抗，再加入上述4組藥物，同時在對照細胞中添加相應的同型對照小鼠IgG2a-PE 10μL，4℃避光放置 30 min，PBS洗 2次，除去未結合一抗，400×g，離心5 min，除去上清液，各管加入500μL PBS重懸；標記好的細胞懸液經200目篩網濾過，用流式細胞儀檢測CD133+細胞（HT-29細胞的干細胞）的比例。

1.5 建立結腸癌荷瘤裸鼠模型 BALB/c裸鼠40只適應性飼養(yǎng)1周，將0.2 mL細胞濃度為5×105/mL HT-29細胞溶于1 mL無血清培養(yǎng)基與matrigel基底膜1∶1混合液中，用微量注射器，接種于BALB/c裸鼠右側腋下，觀察裸鼠成瘤情況，接種部位出現(xiàn)質地較硬的腫瘤結節(jié)等指征認定為成瘤。

1.6 荷瘤裸鼠的治療 將上述荷瘤裸鼠完全隨機分為4組，每組10只。（1）空白對照組，尾靜脈注射生理鹽水，每天1次，每次 0.2 mL。（2）山藥提取物組，按《中國藥典》規(guī)定，小鼠日服劑量是每千克體質量4.5 g（生藥量），提取物提取率為2.78%，故小鼠給藥劑量為125 mg/kg，每天1次灌胃0.2 mL。（3）替加氟組，尾靜脈注射替加氟化療藥物，劑量為36 mg/kg，連續(xù)5 d給藥。（4）聯(lián)合治療組（山藥聯(lián)合替加氟組），尾靜脈注射替加氟化療藥物，劑量為36 mg/kg，連續(xù)5 d給藥；同時按上述山藥提取物組每天1次灌胃0.2 mL配制的溶液。自給藥日起，每天觀察各組小鼠的生存狀況及死亡情況，給藥6周后處死荷瘤鼠，取瘤組織稱質量。計算抑瘤率。抑瘤率=（1-給藥組瘤質量/對照組瘤質量）×100%

1.7 VEGF的檢測 給藥6周后處死4組裸鼠，分離皮下移植瘤組織，先放置在液氮中，然后保存在-80℃的冰箱保存。將移植瘤組織切片，脫水，抗原修復（包括熱修復、胰酶修復等），抑制內源性過氧化物酶，一抗用兔抗VEGF抗體封閉，孵育切片30 min，二抗用山羊抗兔抗體孵育切片30 min，然后用DAB工作液顯色，用蘇木素復染后，鹽酸乙醇分化，再用氨水返藍。自來水沖洗切片、切片脫水、透明、封片，用光學顯微鏡進行檢測。

VEGF讀片標準為+/-：每個高倍視野下，＜2%的癌細胞細胞漿呈棕黃色染色者；+：每個高倍視野下，2%～9%的癌細胞細胞漿呈棕黃色染色者；++：每個高倍視野下，10%～49%的癌細胞細胞漿呈棕黃色染色者；+++：每個高倍視野下，50%～79%的癌細胞細胞漿呈棕黃色染色者；++++：每個高倍視野下，≥80%的癌細胞細胞漿呈棕黃色染色者。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計處理，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用2×2析因設計的方法分析獨立效應和組間交互效應，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 山藥提取物聯(lián)合替加氟對結腸癌HT-29細胞形態(tài)的影響 藥物與細胞共孵育72 h后，倒置顯微鏡下可見，對照組HT-29細胞生長旺盛，折光率較高，胞體大，形態(tài)成梭形或多邊形，胞質均勻透明，核仁清楚，生長良好。3個給藥組細胞增殖減慢，細胞逐漸變小、變圓，折光率減弱，核濃縮，部分脫落漂浮，裂解，見圖1。

2.2 山藥提取物聯(lián)合替加氟對結腸癌HT-29細胞增殖抑制及結腸癌干細胞（CD133+）表達的影響 3個給藥組對結腸癌HT-29細胞增殖能力的抑制作用明顯高于空白對照組（P＜0.05）；聯(lián)合治療組對結腸癌HT-29細胞增殖能力的抑制作用明顯高于山藥提取物組和替加氟組（P＜0.05）；山藥提取物組與替加氟組間差異無統(tǒng)計學意義。與空白對照組相比，3個給藥組細胞中CD133+細胞比例明顯下降（P＜0.05）；聯(lián)合治療組較山藥提取物組、替加氟組明顯下降（P＜0.05）；山藥提取物組與替加氟組差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

Fig.1 Effects of yam extract with tegafur on the morphology of colon cancer HT-29 cells（×400）圖1 山藥提取物聯(lián)合替加氟對結腸癌HT-29細胞形態(tài)的影響（×400）

Tab.1 Effects of yam extract combined with tegafur on the proliferation and proportion of CD133+of colon cancer cell HT-29表1 山藥提取物聯(lián)合替加氟對結腸癌HT-29細胞增殖抑制及CD133+比例的影響 （n=5，±s）

Tab.1 Effects of yam extract combined with tegafur on the proliferation and proportion of CD133+of colon cancer cell HT-29表1 山藥提取物聯(lián)合替加氟對結腸癌HT-29細胞增殖抑制及CD133+比例的影響 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01；表 2 同

組別空白對照組山藥提取物組替加氟組聯(lián)合治療組抑制率（%）0 18.14 19.61 30.85 F 山藥提取物F 替加氟F交互OD值1.086±0.103 0.889±0.091 0.873±0.086 0.751±0.073 28.331＊＊35.221＊＊62.854＊＊CD133+細胞比例（%）36.59±7.62 26.27±6.30 26.01±6.18 17.03±6.03 46.579＊＊45.392＊＊74.136＊＊

2.3 山藥提取物聯(lián)合替加氟對荷瘤裸鼠生存狀況的影響 治療期間，山藥提取物組和聯(lián)合治療組荷瘤裸鼠始終活動自如，進食進水正常，情緒平穩(wěn)?？瞻讓φ战M在治療第3周開始出現(xiàn)活動受阻的現(xiàn)象。替加氟組在注射化療藥物后，荷瘤裸鼠活動減弱，進水進食減少，精神萎靡，出現(xiàn)弓背現(xiàn)象，在治療第2周出現(xiàn)瀕死狀態(tài)。

2.4 山藥提取物聯(lián)合替加氟對荷瘤裸鼠的抑瘤作用 治療后，3個給藥組荷瘤裸鼠的瘤體質量明顯低于空白對照組（P＜0.05），聯(lián)合治療組荷瘤裸鼠的瘤體質量明顯低于山藥提取物組和替加氟組（P＜0.05）；山藥提取物組與替加氟組差異無統(tǒng)計學意義，見表 2，圖 2。

Tab.2 Changes of tumor body mass and inhibitory rates after treatment in four groups表2 各治療組對荷瘤瘤體質量的抑制作用（n=10，±s）

Tab.2 Changes of tumor body mass and inhibitory rates after treatment in four groups表2 各治療組對荷瘤瘤體質量的抑制作用（n=10，±s）

＊＊P＜0.01

組別空白對照組山藥提取物組替加氟組聯(lián)合治療組抑瘤率（%）-15.88 25.34 38.18 F 山藥提取物F 替加氟F交互實體瘤質量（g）2.96±0.52 2.49±0.47a 2.21±0.44a 1.83±0.36abc 32.214＊＊52.684＊＊89.219＊＊

Fig.2 Final tumor volumes after immunotherapy圖2 治療結束各組瘤體積大小

2.5 山藥提取物聯(lián)合替加氟對瘤體VEGF陽性表達率的影響 VEGF表達于細胞膜或胞漿，光鏡下觀察結果，胞漿出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒，染色強度高于背景者為蛋白表達陽性的細胞，強陽性（+++）表達為清晰的棕褐色顆粒。治療后，空白對照組、山藥提取物組、替加氟組、聯(lián)合治療組瘤體VEGF陽性的表達率分別80%、60%、50%、30%，見圖3。

Fig.3 Pictures showing immunohistochemical staining of VEGF in tumor under the optical microscope（×200）圖3 瘤體標本VEGF免疫組化染色光學顯微鏡下觀察（×200）

3 討論

結腸癌是常見的惡性消化道腫瘤，中醫(yī)認為，結腸癌是由于濕、瘀、熱、毒等因素致臟腑功能紊亂、氣血陰陽失調而引起的。CD133為五次跨膜糖蛋白家族的一員，開始被認為是人造血干細胞的選擇標志，近年來的研究表明CD133可以作為鑒定及分離結腸癌腫瘤干細胞的標志［5-6］。

長期以來氟尿嘧啶始終是治療惡性消化道腫瘤的首選藥物，替加氟為氟尿嘧啶的衍生物，在體內逐漸轉變?yōu)榉蜞奏ざ鹱饔?。其抗癌作用方式是以RNA為靶向的細胞毒性作用。有報道替加氟會對消化系統(tǒng)和血液系統(tǒng)產生一系列的不良反應，如胃腸道反應惡心嘔吐、骨髓抑制、白細胞降低、血小板減少等［1］。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外實驗中替加氟可以使結腸癌HT-29細胞逐漸變小，核濃縮，部分脫落漂浮，進而抑制了HT-29細胞的增殖，降低腫瘤干細胞的比例。替加氟對荷瘤裸鼠具有一定的抑瘤作用，抑瘤率達25.34%，但裸鼠出現(xiàn)了活動減少，進水進食減少，精神萎靡等現(xiàn)象，說明化療藥在殺傷腫瘤細胞的同時，對機體的不良反應較大。

中藥應用于臨床抗癌治療歷史悠久。中藥具有多靶點、不易產生耐藥性、不良反應小、多效應、安全性高等優(yōu)點［7］。作為藥食同源的山藥具有較好的抗癌作用［2］，《本草綱目》謂其益腎氣，健脾胃，止泄痢，化痰涎，潤皮毛?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，山藥可誘導黑色素瘤、肺癌、食管癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤細胞凋亡［3-4］。其活性成分包括薯蕷皂苷、尿囊素、山藥多糖［8］、山藥黏液蛋白［9］、黃酮、微量元素等。山藥多糖具有潛在的免疫調節(jié)作用，可體外刺激刀豆蛋白誘發(fā)的T淋巴細胞增生，提升血清中IgG的濃度，進而促進淋巴細胞的增殖［2］。趙國華等［3］用不同劑量的山藥多糖RDPS-Ⅰ喂養(yǎng)荷瘤鼠，當劑量達50 mg/kg時，對Lewis肺癌有抑制效果；當劑量達150 mg/kg時，對Lewis肺癌和B16黑色素瘤均有抑制效果。山藥可通過抑制MAPK、Akt、NF-κB等途徑抑制黏附分子的表達［10］。本實驗室發(fā)現(xiàn)山藥提取物作用于結腸癌HT-29細胞72 h后可使HT-29細胞逐漸變小，核濃縮，部分脫落漂浮，細胞增殖能力減弱，腫瘤干細胞的比例明顯降低；體內動物實驗顯示，山藥提取物對荷瘤裸鼠具有一定的抑瘤效果，治療期間荷瘤裸鼠始終活動自如、進食進水正常，提示山藥提取物在抑瘤的同時不良反應小。山藥提取物聯(lián)合替加氟，在體外的腫瘤細胞增殖抑制實驗和體內抑瘤實驗中均好于單獨使用山藥提取物組或替加氟組，表明山藥提取物和替加氟之間具有協(xié)同作用。

VEGF是腫瘤血管形成［11］、刺激腫瘤細胞進行血液轉移［12］中最重要的生長因子，其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后中具有重要作用，VEGF表達程度反映腫瘤血管內皮細胞增殖、遷移和血管構建水平，直接反映了腫瘤生長的速度和轉移的傾向。因此，抑制VEGF的產生、阻止其發(fā)揮作用是抗腫瘤血管生成進而達到有效治療腫瘤的關鍵［13-15］。本研究通過免疫組化法觀察到聯(lián)合治療組VEGF的陽性表達率明顯低于單獨使用山藥提取物組和替加氟組，結果表明山藥提取物聯(lián)合替加氟通過抑制腫瘤血管生成達到抑制腫瘤的效果，體內、體外實驗結果一致。

據(jù)報道，山藥及其主要成分薯蕷皂苷元可通過調節(jié)脂蛋白脂質酶表達，降低血清中三酰甘油水平，同時通過調節(jié)氧化應激、凋亡等，發(fā)揮預防氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸癌的發(fā)生［16］。以上結果均證明山藥具有較好的抗腫瘤活性，且在聯(lián)合化療藥應用方面具有較好的前景。

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