慢病毒介導(dǎo)的PRL-3 shRNA 對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響

王燕，張姣，王會峰，王寧菊

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤之一，中國國家癌癥登記中心調(diào)查發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌發(fā)病率居我國惡性腫瘤的第4位，死亡率居第5位［1］。目前已證實肝再生磷酸酶-3（PRL-3）在結(jié)腸癌中高表達［2］，且PRL-3能啟動結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［3］，但是確切的分子機制尚需要進一步研究。本課題組前期研究證實靶向PRL-3基因的shRNA慢病毒載體可以明顯抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的PRL-3基因表達水平，后續(xù)功能實驗均選擇PRL-3 shRNA進行。本研究利用已構(gòu)建的慢病毒載體感染SW480細(xì)胞，進一步探討PRL-3基因沉默后對人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人結(jié)直腸癌SW480為寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心保存，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Ausbian公司），TRIzol（上海普飛公司）、MTT試劑（Genview公司）；DMSO（上海試一化學(xué)試劑有限公司）；SYBR Master Mixture試劑盒（TaKaRa公司），D-Hanks、PRL-3 shRNA、陰性對照的慢病毒顆粒（上海吉凱基因技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（Tecan infinite）；DMEM、侵襲試劑盒及 Transwell試劑盒（Corning公司），胰酶（上?；瘜W(xué)試劑公司），細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-FITC（eBioscience公司），GIEMSA染色液（Sigma公司）。Real time PCR儀（Agilent公司），熒光顯微鏡（奧林巴斯），離心機（賽默飛世爾科技中國有限公司），倒置顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司），CO2培養(yǎng)箱（SANYO），生物安全柜（上海振梓創(chuàng)電氣凈化設(shè)備有限公司），流式細(xì)胞儀（Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SW480細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃恒溫，5%CO2條件下持續(xù)培養(yǎng)，所有的實驗要求細(xì)胞的生長狀態(tài)為對數(shù)生長期。

1.2.2 慢病毒PRL-3 shRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞株 SW480細(xì)胞接種于12孔板中，4×104個/孔，當(dāng)每孔細(xì)胞密度大約20%時，分別加入慢病毒PRL-3 shRNA、陰性對照的慢病毒顆粒，進行SW480細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，16 h更換培養(yǎng)基，72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）表達效率。實驗分組：空白對照組（細(xì)胞不作處理）、陰性對照組（陰性對照病毒組）、轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染慢病毒PRL-3 shRNA組）。

1.2.3 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞中PRL-3 mRNA表達 收集各個實驗組對數(shù)生長期的細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)PRL-3 mRNA表達水平，內(nèi)參為GAPDH。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 30 s；95℃ 5 s，60℃退火 30 s，45個循環(huán)。引物序列：PRL-3上游引物 5′-GATGGCATCACCGTTGTGGA-3′，下 游 引 物 5′-CGTACTTCATCCCGCTCTCAAT-3′，擴 增 片 段 199 bp；GADPH 上游引物 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物 5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴增片段121 bp；由上海吉凱基因生物公司合成。采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 平板克隆形成實驗 PRL-3 shRNA、陰性對照的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后第5天種板，持續(xù)培養(yǎng)5 d，每3 d換液1次。按400個細(xì)胞/孔分別接種到6孔板中，使細(xì)胞分散均勻。分空白對照組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染組，繼續(xù)培養(yǎng)1周，直到可見克隆生長時，按照GIEMSA染色法進行染色，鏡檢計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測PRL-3 shRNA轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞凋亡的影響 PRL-3 shRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后第3天傳代，第5天檢測，細(xì)胞融合度達85%以上，收集各組細(xì)胞各1.0×105個，PBS洗3次，上流式細(xì)胞儀單染法檢測細(xì)胞凋亡率變化。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 MTT法檢測PRL-3 shRNA對細(xì)胞增殖的影響 收集各個實驗組細(xì)胞，待每組細(xì)胞生長狀態(tài)良好后，接種96孔板，密度為1×104個/孔，設(shè)重復(fù)孔，按照MTT試劑操作方法進行，用酶聯(lián)免疫標(biāo)記分析儀測其光密度（OD）值，連續(xù)5 d。重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell小室法檢測PRL-3 shRNA對SW480細(xì)胞遷移能力的影響 收集空白對照組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染組（PRL-3 shRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后72 h）細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×105個，棄培養(yǎng)基并加入100μL細(xì)胞懸液，下室內(nèi)加入600μL 30%FBS的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)34 h后，用GIEMSA染色液進行染色，鏡檢計數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)，每個樣本隨機計數(shù)5個視野，取平均值，實驗重復(fù)3次。

1.2.8 侵襲小室法檢測PRL-3 shRNA對SW480細(xì)胞侵襲能力的影響 收集空白對照組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染組（PRL-3 shRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后72 h）細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×105個，實驗前將上、下小室各加500μL無血清培養(yǎng)基，使Matrigel基質(zhì)層再水化。水化后上室加入500μL細(xì)胞懸液，下室內(nèi)750μL 30%胎牛血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)34 h后，用濕棉拭子輕輕移去小室內(nèi)未轉(zhuǎn)移細(xì)胞，GIEMSA染色，倒置顯微鏡下計數(shù)，觀察侵襲Matrigel基質(zhì)層后的細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒PRL-3 shRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 將PRL-3 shRNA和陰性對照組的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480并培養(yǎng)72 h后，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，可見GFP表達的細(xì)胞比例達80%以上，慢病毒PRL-3 shRNA成功轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞并穩(wěn)定表達，后續(xù)實驗可以進行，見圖1。

2.2 PRL-3 shRNA轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞后mRNA表達水平 將PRL-3 shRNA和陰性對照的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞72 h后，細(xì)胞生長良好，real-time PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組PRL-3 mRNA相對表達水平低于空白對照組、陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組PRL-3基因敲減效率達到89.6%。空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.3 平板克隆形成實驗結(jié)果 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆形成數(shù)量較空白對照組、陰性對照組明顯減少（P＜0.05），而空白對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

Fig.1 The expression of green fluorescent protein in SW480 cells infected with lentivirus PRL-3 shRNA圖1 慢病毒PRL-3 shRNA感染SW480細(xì)胞后GFP的表達（×100）

Tab.1 Changes of relative expression of PRL-3 mRNA,colony formation and the apoptosis rate of SW480 cells after transfection表1 轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞PRL-3 mRNA、克隆形成、凋亡的變化 （n=3，±s）

Tab.1 Changes of relative expression of PRL-3 mRNA,colony formation and the apoptosis rate of SW480 cells after transfection表1 轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞PRL-3 mRNA、克隆形成、凋亡的變化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與陰性對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組轉(zhuǎn)染組F PRL-3 mRNA 0.864±0.124 1.001±0.044 0.105±0.014ab 120.342＊＊克隆形成（個）123.000±7.211 119.670±5.508 38.330±3.512ab 218.577＊＊凋亡率（%）4.811±0.290 4.816±0.317 8.600±0.174ab 25.841＊＊

Tab.2 The MTT result of proliferation of SW480 cells after transfected PRL-3-shRNA表2MTT法檢測轉(zhuǎn)染PRL-3-shRNA后SW480細(xì)胞增殖能力的影響 （n=3，OD值，±s）

Tab.2 The MTT result of proliferation of SW480 cells after transfected PRL-3-shRNA表2MTT法檢測轉(zhuǎn)染PRL-3-shRNA后SW480細(xì)胞增殖能力的影響 （n=3，OD值，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與陰性對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組轉(zhuǎn)染組F 24 h 0.157±0.004 0.149±0.003 0.153±0.002 4.483 48 h 0.388±0.025 0.369±0.006 0.353±0.005 3.985 72 h 0.737±0.012 0.638±0.027 0.378±0.011ab 40.597＊＊96 h 1.197±0.021 0.948±0.044 0.471±0.001ab 525.360＊＊120 h 1.865±0.039 1.492±0.019 0.671±0.029ab 1 260.359＊＊

2.4 PRL-3 shRNA轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞凋亡率的變化 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率與空白對照組、陰性對照組比較均顯著增高（P＜0.05），而空白對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.5 轉(zhuǎn)染PRL-3 shRNA后SW480細(xì)胞增殖能力的變化 轉(zhuǎn)染組感染24、48 h后與空白對照組及陰性對照組比較，細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義，轉(zhuǎn)染72 h后，轉(zhuǎn)染組與空白對照組及陰性對照組比較，細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制（P＜0.05），轉(zhuǎn)染120 h抑制更為顯著，見表2。

2.6 轉(zhuǎn)染PRL-3-shRNA后SW480細(xì)胞遷移和侵襲力變化 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移和侵襲力較空白對照組、陰性對照組比較均顯著下降（P＜0.05），而空白對照組與陰性對照組遷移和侵襲力相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2、表3。

3 討論

PRLs是近年來發(fā)現(xiàn)的癌基因家族。PRLs家族成員包括 PRL-1、2、3，PRL-1、2 能使細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。PRL-3參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，在結(jié)直腸癌［2］、非小細(xì)胞肺癌［4］、卵巢癌［5］、前列腺癌［6］和乳腺癌［7］中表達上調(diào)，在腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、遷徙及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的正向調(diào)控作用。抑制PRL-3的表達會減弱三陰性乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力［7］。劉楠等［8］發(fā)現(xiàn)下調(diào)高轉(zhuǎn)移潛能的肺癌A549細(xì)胞中PRL-3的表達水平后，A549細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯降低，但增殖能力沒有明顯變化，提示PRL-3在肺癌中發(fā)揮的作用可能與在其他類型的腫瘤不同。PRL-3在腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而對結(jié)腸癌細(xì)胞是否有影響需要進一步研究。

Fig.2 Migration and invasion of SW480 cells after transfection detected by Transwell assay and invasion assay(×100)圖2 Transwell小室和侵襲小室法檢測轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞遷移和侵襲力變化（×100）

Tab.3 Changes of migration and invasion of SW480 cells after transfection表3 轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞遷移及侵襲力的變化（n=3，個，±s）

Tab.3 Changes of migration and invasion of SW480 cells after transfection表3 轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞遷移及侵襲力的變化（n=3，個，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與陰性對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組轉(zhuǎn)染組F細(xì)胞遷移116.670±3.215 112.000±1.732 73.670±5.508ab 114.740＊＊細(xì)胞侵襲65.000±3.000 66.330±0.577 38.670±6.110ab 46.950＊＊

慢病毒載體廣泛應(yīng)用于穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因過表達、制備不同種類的轉(zhuǎn)基因動物、持續(xù)的基因沉默等方面，具有不良反應(yīng)低、轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)勢。本研究利用已構(gòu)建的慢病毒載體轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，real-time PCR結(jié)果顯示該慢病毒載體對SW480細(xì)胞中PRL-3基因的敲減效率達到89.6%，該重組慢病毒載體能夠有效地抑制SW480細(xì)胞中PRL-3基因的表達，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，這也證實了慢病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)轉(zhuǎn)染效率高，是基因治療的重要工具。本研究顯示下調(diào)PRL-3的表達水平使SW480細(xì)胞存活率明顯受到抑制，說明通過沉默PRL-3基因表達，可以抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖。本研究轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組及陰性對照組，與卵巢癌［5］、前列腺癌［6］中 PRL-3 的研究結(jié)果一致：PRL-3促進卵巢癌、前列腺癌細(xì)胞的生長和遷移，沉默PRL-3抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特征?，F(xiàn)有的研究顯示PRL-3促進腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制主要有以下幾個方面：（1）PRL-3可能通過改變RhoA、RhoC活性及其下游因子影響肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲［4，8］。（2）上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。PRL-3可能通過EMT途徑影響結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲。Lai等［3］發(fā)現(xiàn)PRL-3誘導(dǎo)KCNN4表達，導(dǎo)致EMT和E-鈣黏蛋白下調(diào)，促進腫瘤轉(zhuǎn)移。（3）張建龍等［9］發(fā)現(xiàn) PRL-3 通過上調(diào)miRNA-21抑制PTEN表達，調(diào)節(jié)PI3K通路，從而促進結(jié)腸癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。（4）Gari等［7］用特異性抑制劑AMPI-109降低PRL-3表達水平后，三陰性乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力明顯降低；PRL-3過表達通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-10促進三陰性乳腺癌細(xì)胞的侵襲。以上研究顯示PRL-3參與多水平調(diào)控及信號通路，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，PRL-3在肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等腫瘤中的作用機制不同，可能與腫瘤的異質(zhì)性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：與空白對照組及陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組穿越Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示下調(diào)PRL-3后，可以減弱結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

本研究表明，PRL-3在調(diào)控結(jié)腸癌增殖、侵襲、凋亡過程中起著重要作用，PRL-3可能作為結(jié)腸癌患者早期診斷、治療選擇的分子標(biāo)志物。本課題不足之處在于未對PRL-3調(diào)控結(jié)腸癌致病機制進行深入研究。后續(xù)研究重點將關(guān)注PRL-3可能通過影響哪些下游靶基因的表達影響結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移及其可能的分子機制，以期為結(jié)腸癌的靶向治療提供更多依據(jù)。

［1］陳萬青，鄭榮壽，張思維，等.2013年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析［J］.中國腫瘤，2017，26（1）：1-7.Cheng WQ，Zheng RS，Zhang SW，et al.Report of cancer incidence and mortality in China，2013［J］.China Oncology，2017，26（1）：1-7.doi:10.11735/j.issn.1004-0242.2017.01.A001.

［2］Kim NW，Chu CW，Ahn TS，et al.Correlation between liver metastases and the level of PRL-3 mRNA expression in patients with primary colorectal cancer［J］.J Korean Soc Coloproctol，2011，27（5）：231-236.doi:10.3393/jksc.2011.27.5.231.

［3］Lai W，Liu L，Zeng Y，et al．KCNN4 channels participate in the EMT induced by PRL-3 in colorectal cancer［J］． Med Oncol，2013，30（2）：566-574.

［4］張平，張志培，李香敏，等.非小細(xì)胞肺癌中PRL-3與RHOc的表達及相關(guān)性意義［J］.中國肺癌雜志，2010，13（6）：598-601.Zhang P，Zhang ZP，Li XM，et al.Expression and it’s relationship of PRL-3 and Rhoc in non-small cell lung cancer［J］． Chinese Journal of Lung Cancer，2010，13（6）：598-601.doi:10.3779/j.issn.1009-3419.2010.06.006.

［5］Liu H，Al-aidaroos AQ，Wang H，et al.PRL-3 suppresses c-Fos and integrin alpha2 expression in ovarian cancer cells［J］.BMC Cancer，2013，13：80.doi:10.1186/1471-2407-13-80.

［6］Vandsemb EN，Bertilsson H，Abdollahi P，et al.Phosphatase of regenerating liver 3（PRL-3）is overexpressed in human prostate cancer tissue and promotes growth and migration［J］.J Transl Med，2016，14：71.doi:10.1186/s12967-016-0830-z..

［7］Gari HH，DeGala GD，Ray R，et al.PRL-3 engages the focal adhesion pathway in triple-negative breast cancer cells to alter actin structure and substrate adhesion properties critical for cell migration and invasion［J］.Cancer Lett，2016，380（2）：505-512.doi:10.1016/j.canlet.2016.07.017.

［8］劉楠，王力寧，姜奕，等.PRL-3對肺癌細(xì)胞遷移侵襲及RHOA活性調(diào)控的研究［J］.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2013，7（7）：2995-3000.Liu N，Wang LN，Jiang Y，et al.Research of PRL-3 regulates cell migration，invasion and RhoA activity in lung cancer cell［J］.Chin J Clinicians（Electronic Edition），2013，7（7）：2995-3000.doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2013.07.103.

［9］張建龍，張縈斐，張育超，等.PRL-3調(diào)節(jié)PI3K信號通路在促進結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲中的作用［J］.中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2013，34（1）：16-21.Zhang JL，Zhang YF，Zhang YC，et al.PRL-3 promotes proliferation and invasion of colon cancer cells by modulating P13K signal pathway［J］.J Sun Yat-sen Univ（Med Sci），2013，34（1）：16-21.