優(yōu)化冰凍血小板制備條件的初步研究

孫瑜，翁美芝，熊莉，徐翠玲，付文霞，袁蝦，樊立榮，吳紅，李國良

(江西省血液中心，江西 南昌 330000)

對(duì)因血小板缺失導(dǎo)致的出血性疾病，輸注血小板是特異性的治療方法[1-4]，但應(yīng)急情況下新鮮血小板來源不足，且保存條件有利于細(xì)菌生長，直接限制了臨床應(yīng)用。為更好的滿足臨床需求，各國均在研究延長血小板保存期限的方法，我國1989年便有文獻(xiàn)[5]報(bào)導(dǎo)應(yīng)用DMSO保存濃縮血小板。但冰凍血小板的制備操作過程嚴(yán)格，貯存條件高，解凍后血小板容易出現(xiàn)絮狀物，影響質(zhì)量，甚至報(bào)廢，為提高冰凍血小板的保存質(zhì)量，保護(hù)受血者利益，我中心根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)嘗試使用不同濃度的二甲基亞砜（dimethylsulphoxide，DMSO），選擇不同條件制備冰凍血小板，并選擇不同溫度融化冰凍血小板，以期尋找出最適合制備冰凍血小板的方法。現(xiàn)匯報(bào)如下：

1 材料與方法

1.1 獻(xiàn)血者選擇 隨機(jī)選擇我中心無償獻(xiàn)血者，年齡（18~47周歲），男18例，女30例，遵循知情同意原則抽取本人全血400ml，制備手工血小板。

1.2 儀器與設(shè)備 赫立氏6000i離心機(jī) （美國熱電公司），血小板振蕩儀（蘇州醫(yī)用儀器廠），-80℃深低溫冰箱，（三洋），速凍機(jī)（多美達(dá)），循環(huán)水浴箱（濰坊普華），全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（希森美康）

1.3 試劑 DMSO（Lot：USP4F1S，德國 WAK），生理鹽水（Lot：160302 31A，上海輸血技術(shù)有限公司）

1.4 方法

1.4.1 手工血小板的制備 使用富漿法制備手工血小板，離心程序?yàn)?1200g×9min，22℃；3000g×4min，22℃，保留60g終產(chǎn)品置于血小板保存袋中，并將每袋血小板以無菌接管機(jī)分成20gX2袋，余下的作為濃縮血小板對(duì)照組，均置于血小板振蕩儀中振蕩保存；

1.4.2 75%DMSO的配制 由DMSO原液與0.9%NaCl以3：1的體積比在無菌條件下配制，配好后置于-50℃冰箱保存，使用前取出，無須室溫平衡。

1.4.3 冰凍血小板的制備

1.4.3.1 使用DMSO原液制備冰凍血小板 在百級(jí)無菌室內(nèi)，以加藥件按1ml/min的速度緩慢將DMSO原液加入血小板懸液深部，邊加邊振（頻率60次/min），充分混勻，使終濃度為5%，振蕩8min后-80℃冰凍保存；

1.4.3.2 使用75%DMSO制備冰凍血小板：按公式“血小板凈重(g)×0.071”計(jì)算，即得終產(chǎn)品內(nèi)DMSO達(dá)5%濃度所需的75%DMSO體積，用前取出75%DMSO，以注射器直接加入血小板袋內(nèi)，邊加邊振（頻率無要求），直接搖均，使之終濃度為5%，迅速置-80℃保存；

1.4.4 冰凍血小板的融化 從-80℃深低溫冰箱中取出冰凍血小板，迅速置于38℃水浴或或流動(dòng)自來水中融化。

1.4.5 實(shí)驗(yàn)分組 將48例獻(xiàn)血者制備的共96袋冰凍血小板隨機(jī)分成2組，每組24例48袋，每組均按冰凍液與融化條件中固定其一的原則，共分4大組；組1與組2為配對(duì)組，使用同一人的冰凍血小板；組3與組4為配對(duì)組，使用同一人的冰凍血小板，詳見表1。

表1 冰凍血小板實(shí)驗(yàn)分組（n=96）

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用excel2007[6-8]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)分析選擇t檢驗(yàn)，以配對(duì)t檢驗(yàn)行兩兩配對(duì)組比較；計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)分析選擇χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 冰凍前、解凍后血小板的質(zhì)量檢測(cè)均合格，冰凍保存過程中各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 血小板回收率 （%Recovery)(復(fù)蘇后血小板計(jì)數(shù)/冰凍前血小板計(jì)數(shù))，血小板平均體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)的比較見表2。

表2 濃縮血小板冰凍前、后血小板回收率、MPV、PDW的比較（x±s）

2.3 絮狀物的出現(xiàn)

2.3.1 本實(shí)驗(yàn)中，流動(dòng)自來水融解時(shí)有1袋（1/48）出現(xiàn)絮狀物（χ2=9.5174，P＞0.05）。

2.3.2 本中心制備的冰凍單采血小板中出現(xiàn)絮狀物的概率見表3。

表3 不同濃度的DMSO對(duì)冰凍單采血小板復(fù)蘇后絮狀物的影響

3 討論

DMSO作為低溫保護(hù)劑有許多優(yōu)點(diǎn)[9]，如可靜脈輸注，安全劑量0.92g/kg體重，制備的冰凍血小板無需洗滌，復(fù)溫后可直接輸注[10]，該試劑已廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞保存中。在冰凍血小板的使用上，5%的DMSO的終濃度在安全劑量范圍內(nèi)，但目前，冰凍血小板尚未大量使用[11]，國內(nèi)《全血與成分血質(zhì)量要求》（GB18469-2012）中也未提出該產(chǎn)品的具體質(zhì)控指標(biāo)，如何通過大量數(shù)據(jù)的積累，使冰凍血小板的質(zhì)量規(guī)范盡早出臺(tái)，緩解我國因人數(shù)巨大而導(dǎo)致的血小板的臨床供需矛盾已成為血站成分制備的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

本次實(shí)驗(yàn)沒有以血小板直接計(jì)數(shù)來判斷冰凍效果，而是選擇了復(fù)蘇后血小板的回收率作為衡量指標(biāo)，因本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇無償獻(xiàn)血者作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，而非單采獻(xiàn)血者，對(duì)其制備后的血小板含量無明確要求，血小板回收率更能反映制備效果，且更有可比性。

隨機(jī)分組冰凍血小板，濃縮血小板冰凍前、后血小板回收率、MPV、PDW的比較均顯示兩個(gè)對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有趣的是，四個(gè)組與冰凍前相比，其差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以無法據(jù)此判斷到底哪一種方法更為理想。但根據(jù)許多文獻(xiàn)[12，13]顯示，冰凍血小板復(fù)蘇后，至少血小板回收率的指標(biāo)在冰凍前與解凍后均無顯著性差異，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能由以下原因?qū)е拢阂?、樣本量過?。欢?、48袋血小板的濃縮、分袋、冰凍與解凍由若干工作人員完成，手法有差異；三、濃縮血小板的紅細(xì)胞混入量高于單采血小板，在制備冰凍解凍血小板時(shí)對(duì)計(jì)數(shù)有影響。僅就本次實(shí)驗(yàn)中的血小板回收率的均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差而言，75%DMSO制備的冰凍血小板回收率較好，但也僅在85%左右徘徊，這符合國外學(xué)者認(rèn)為的凍存與解凍過程中，一般有15%-40%的血小板損失的結(jié)論[14]。

冷凍血小板融解后出現(xiàn)絮狀物一般有兩大因素：⑴纖維蛋白析出和血小板損傷[15]。⑵DMSO注入過快產(chǎn)生高熱量，灼傷血漿蛋白，導(dǎo)致絮狀物析出。但是，75%的DMSO制備后置入-50℃的冰箱內(nèi)保存，在制備冰凍血小板需加樣方取出，該溫度可有效平衡DMSO的水合放熱，避免血漿蛋白的變性與血小板的激活，有效防止絮狀物的產(chǎn)生。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)的絮狀物出現(xiàn)的絕對(duì)值和統(tǒng)計(jì)分析情況，75%的DMSO制備的冰凍血小板與38℃水浴復(fù)蘇冰凍血小板絮狀物的產(chǎn)生更少。因此，75%的DMSO更適合制備的冰凍血小板。

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