利用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增16S rRNA對無乳鏈球菌快速鑒定的新方法

肖偉強(qiáng)，潘軍，姚新偉，常彥敏，孫明月，許青霞，周麗莉

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000)

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是 B組鏈球菌 (Group B Streptococcus，GBS)唯一的一個種，是造成孕產(chǎn)婦生殖道感染的重要原因，嚴(yán)重時更可引起泌尿系感染、絨毛膜羊膜炎、產(chǎn)褥感染、新生兒感染等[1，2]。目前無乳鏈球菌的檢測方法有傳統(tǒng)培養(yǎng)、乳膠凝集實驗、免疫層析、實時熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)恒溫恒溫擴(kuò)增 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的方法等。LAMP 由日本科學(xué)家Notomi發(fā)明[3]，反應(yīng)只需要把基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶、基質(zhì)等共同置于一定溫度下 （60～65℃），可在15~60min內(nèi)實現(xiàn)109~1010倍的擴(kuò)增，最后形成具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)長短不一的多個雙鏈DNA。LAMP擴(kuò)增效率高，操作簡單，特異性強(qiáng)，底物檢測方便，廣泛用于細(xì)菌類病原微生物的現(xiàn)場檢測。無乳鏈球菌特異性靶基因主要有cfb基因、16S rRNA、16S-23srRNA基因的間隔區(qū)和scpB和ssrA基因等[4]。BLAST比對證明無乳鏈球菌和停乳鏈球菌16S rRNA相似度超過95%，僅在個別位點有差異，引物設(shè)計較難，因此很少有人把16S rRNA作為LAMP擴(kuò)增GBS的靶基因。本文欲在此設(shè)計引物，一方面來探討以16S rRNA為靶基因來檢測GBS的可行性，另一方面來檢驗LAMP方法對序列極其相似的靶基因的區(qū)分能力。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源 無乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株55191購自ATCC，其余52株無乳鏈球菌和其他131株非無乳鏈球菌（包括化膿鏈球菌12株、停乳鏈球菌停乳亞種11株、停乳鏈球菌似馬亞種23株、馬鏈球菌6株、咽峽炎鏈球菌10株、糞腸球菌20株、中間鏈球菌3株、牛鏈球菌4株、屎腸球菌26株、金黃色葡萄球菌7株、鉛黃腸球菌9株）均來自我室不同時期臨床的分離株。所有無乳鏈球菌、停乳鏈球菌停乳亞種、停乳鏈球菌似馬亞種均再次經(jīng)過16S rRNA通用擴(kuò)增測序后比對確證，方法見文獻(xiàn)[5]。

1.2 儀器與試劑 Bst DNA聚合酶、dNTPs、DNAMarker、細(xì)菌總DNA提取試劑盒均購自大連寶生物，金屬浴和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，引物合成由上海生工技術(shù)有限公司完成，其他試劑均購自日本Takara公司。

1.3 LAMP引物設(shè)計 選擇無乳鏈球菌16s rRNA參考基因 NR_040821.1、NR_113262.1、NR_115728.1、NR_117503.1，軟件DNAMAN7.0比對，選擇的序列為無乳鏈球菌的保守區(qū)，停乳鏈球菌的可變區(qū)。Primer Explorer(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)在線設(shè)計共4條引物：正向外部引物F3，反向外部引物B3，和帶有互補(bǔ)序列的正向內(nèi)部引物FIP和反向內(nèi)部引物BIP，具體位置和序列詳見圖1。

圖1 LAMP引物位置及序列

1.4 LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系 反應(yīng)體系 25μl，包括：10xBst buffer 【20mMpH 為 8.8 的 Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1%Triton-100】，25mM MgCl2，2.5mM dNTPs，5M betaine，內(nèi)引物(FIP 和 BIP)，外引物(F3 和 B3)，Bst DNA 聚合酶，DNA 模板，ddH2O，SYBR Green I。 結(jié)果判讀采用自然光顯色、熒光顯色和2%瓊脂糖凝膠電泳分析的方法。

1.5 LAMP擴(kuò)增的條件優(yōu)化 首先固定LAMP反應(yīng)體系中 FIP/BIP引物的濃度為 1.6μM，F(xiàn)3/B3為0.4μM，模板 2μl，Bst DNA聚合酶最佳反應(yīng)溫度60℃，然后逐一分別配制梯度濃度的dNTPs、betaine、鎂離子，各自采用不同的反應(yīng)時間，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果對LAMP反應(yīng)體系中的以上變量進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 LAMP擴(kuò)增特異性檢測 用優(yōu)化后的LAMP方法對52株無乳鏈球菌和131株非無乳鏈球菌進(jìn)行擴(kuò)增，計算假陰性和假陽性。

1.7 LAMP擴(kuò)增敏感性檢測 將無乳鏈球菌55191接種于 Luria-Bertani培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 18~24h[6]，取100μl菌液進(jìn)行平板計數(shù)，之后，將菌液做101~106倍6個梯度的稀釋，煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA，分別取 2μl做 LAMP和 Real Time PCR檢測，比較兩種方法的靈敏度。

2 結(jié)果

2.1 LAMP擴(kuò)增條件優(yōu)化 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳條帶的亮度，最終確定25μl反應(yīng)體系中dNTPs、betaine、鎂離子分別為 0.6mM、1.0M、12mM，最佳反應(yīng)時間為60min。

2.2 特異性檢測 僅52株無乳鏈球菌產(chǎn)生梯度條帶，其他細(xì)菌（包括34株停乳鏈球菌）均無任何條帶（圖 2）。

圖2 部分無乳鏈球菌和停乳鏈球菌LAMP擴(kuò)增結(jié)果

2.3 敏感性檢測 經(jīng)平板菌落計數(shù)，原始菌液濃度為3.8×105cfu/ml。將原始菌液做101~106倍6個梯度的稀釋，相同方法提取基因組DNA，分別取2μl做PCR和LAMP檢測，結(jié)果顯示，LAMP能檢出104倍的稀釋，而普通PCR僅能檢出102倍的稀釋，前者比后者的靈敏度高出近100倍（圖3）。

圖3 無乳鏈球菌敏感性檢測

3 討論

16S rRNA是細(xì)菌的系統(tǒng)分類研究中最有用的和最常用的分子鐘，其分子大小適中，存在于所有的生物中，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，素有“細(xì)菌化石”之稱，因此根據(jù)細(xì)菌16S rRNA可變區(qū)的差異可以用來區(qū)分不同的菌，目前已成為細(xì)菌種屬鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法[7]。但16S rRNA序列在原核生物中的高度保守性，對于相近種或同一種內(nèi)的不同菌株之間的鑒別分辨力較差，特別是在某些菌屬中，16S rRNA有時差異很小，這就給LAMP引物設(shè)計帶來難度，所以目前僅有軍團(tuán)菌等少數(shù)細(xì)菌的LAMP檢測試劑盒的靶基因為16S rRNA[8]，其余LAMP檢測試劑盒多在特異性功能蛋白基因上，或者變異度更大的16S-23S rRNA間隔區(qū)(Intergen ic Spacer Region，ISR)[9]。美國 Yanhong Liu[10]開發(fā)了一種環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增的方法來區(qū)分停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌，他利用16s-23s的間隔區(qū)設(shè)計了三組引物，分別識別這三種細(xì)菌，證明環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增的方法時間短，靈敏度高，能識別0.1pg的目標(biāo)底物的模板。本文在16S rRNA處設(shè)計引物，克服了種間序列區(qū)分的難度，也成功區(qū)分了上述細(xì)菌，并且具有很高的敏感性和特異性，證明LAMP對GBS檢出的可行性；而且，與Yanhong Liu等人的方法相比，本文更加簡單方便，在16S rRNA處設(shè)計引物，可用于任何細(xì)菌，比選擇單純的功能性蛋白基因或其他特異性基因，具有更好的通用性。

LAMP擴(kuò)增的特異性與其引物設(shè)計有很大關(guān)系。本課題中，引物靶基因參考了Genbank數(shù)據(jù)庫中6條無乳鏈球菌16S rRNA的參考基因，并且盡量選擇了其保守區(qū)，但相對停乳鏈球菌則位于最大變異區(qū)，所以能有效區(qū)分無乳鏈球菌和停乳鏈球菌。本文的52株無乳鏈球菌均能產(chǎn)生梯度條帶，其他細(xì)菌包括停乳鏈球菌均無任何條帶，說明本方法對僅有個別堿基差異的16S rRNA也能有效區(qū)分，具有很好的特異性。

LAMP擴(kuò)增的敏感性方面，本文證實每ml低至40個菌落即可檢出，顯示出其超高的敏感性。McKenna JP等人利用LAMP技術(shù)擴(kuò)增GBS的sip基因，證明具有100%的特異性，并能檢出最少14各拷貝的基因[11，12]；日本 Kimura[13]也曾利用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增的方法來擴(kuò)增GBS的cfb基因，證明這種方法在恒溫的條件下能發(fā)現(xiàn)4個拷貝的模板基因，結(jié)合本文的實驗證實，LAMP方法對無乳鏈球菌的檢測具有準(zhǔn)確、高效、靈敏等特點。但隨之而來的，LAMP擴(kuò)增的高靈敏性帶來了不可避免的缺點是假陽性高，因此，盡可能所有反應(yīng)均在單一閉合管中進(jìn)行，避免開蓋污染。本文即在上蓋中，預(yù)加入SYBR Green I，待反應(yīng)結(jié)束后上下混勻顯色，能有效避免污染。

本文的LAMP擴(kuò)增優(yōu)化的條件在1h內(nèi)完成，有人在4條引物的基礎(chǔ)上設(shè)計了一對環(huán)狀引物，能大大加快反應(yīng)速度，在30min內(nèi)既能完成檢測，大大降低了LAMP現(xiàn)場檢測的要求[14，15]。對于本文環(huán)狀引物的適用，還需要進(jìn)一步研究。

總之，本文設(shè)計的在16S rRNA處擴(kuò)增無乳鏈球菌具有很高的靈敏度和特異性，能有效區(qū)分序列高度近似的停乳鏈球菌和無乳鏈球菌。如果利用可隨身攜帶的實時熒光檢測儀，就能在床邊完成對無乳鏈球菌快速、簡單、隨機(jī)的操作，具有很大的市場前景。

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