加味黃芪赤風湯對阿霉素誘導腎小球足細胞凋亡的影響?

李 雙，李 澎，張 昱△，楊 斌，李劉生，許勇鋼，郝 偉，趙晉寧

(1. 中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院腎病科，北京 100091； 2. 中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院實驗研究中心，北京 100091)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是各種慢性腎臟疾病的總稱，隨著CKD病情進展，患者的腎功能將進一步下降進而發(fā)展為慢性腎衰竭，最終進入終末期腎臟病，給家庭和社會帶來沉重的負擔。張路霞等[1]對47204名中國成年人(18～95歲)進行橫斷面研究，其中CKD患者約占10.8%，相當于全國有1.2億左右成年人患有不同程度的CKD。蛋白尿尤其是長期持續(xù)的大量蛋白尿是加速CKD進展的獨立危險因素，在CKD早期積極干預(yù)治療，對延緩CKD的進展至關(guān)重要。足細胞是構(gòu)成腎小球濾過膜的最后屏障，其損傷是導致蛋白尿的重要原因，在CKD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年來，足細胞病變在腎小球疾病進展中的作用日益成為人們關(guān)注的焦點。加味黃芪赤風湯是張昱教授經(jīng)過多年臨床實踐，衷中參西，不斷增減變化而形成的治療CKD蛋白尿行之有效的方劑。我們前期研究證實，加味黃芪赤風湯能夠顯著減少阿霉素大鼠尿蛋白，改善腎臟纖維化[2-4],并能夠緩解脂多糖誘導的腎小球系膜細胞惡性表型[5-6]。本研究立足于加味黃芪赤風湯對阿霉素(adriamycin，ADR)誘導腎小球足細胞凋亡(apoptosis)的影響，以探討該方對足細胞損傷的保護機制。

1 材料

1.1 實驗動物

健康VAF/SPF 級SD雄性大鼠63只，體質(zhì)量(250±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(合格證編號SCXK(京)2012-0001)。實驗期間飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院SPF級動物房，溫度在 24 ℃～28 ℃，濕度75%左右，以標準飼料飼養(yǎng)，自由飲水及攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d。

1.2 實驗細胞

小鼠腎小球足細胞(mouse podocyte，資源編號3111C0001CCC000230)由國家實驗細胞資源共享平臺提供。

1.3 實驗藥品

加味黃芪赤風湯組成：生黃芪30 g，赤芍20 g，防風10 g，芡實10 g，金櫻子10 g，穿山龍20 g，白花蛇舌草10 g，飲片來自于中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院草藥房，分別煎煮濃縮至1.140、0.570和0.285 g(生藥)/ml。 替米沙坦片(80 mg/片，勃林格殷格翰(德國)生產(chǎn)，批號D1420006572)160 mg研制成粉溶于384 mL純凈水，按0.417 mg/mL配制成混懸液，4 ℃冰箱密封保存。

1.4 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清、胰酶(GIBCO公司)；阿霉素、鏈霉素、青霉素、重組小鼠γ-干擾素(Sigma公司)；RIPA裂解液、PMSF(北京艾德生物科技有限公司提供)；AnnexinV/FITC試劑盒(BD公司)；透射電子顯微鏡(FEI TECNAI G2 SPIRIT)；紫外分光光度計(德國Biophotometer公司)；轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司)等。

2 方法

2.1 含藥血清制備

63只大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組，其中空白組15只大鼠每次灌服等量純凈水，替米沙坦組12只大鼠每次按0.417 mg/ml灌服，加味黃芪赤風湯分別按高、中、低劑量組每組12只每次按1.140、0.570、0.285 g(生藥)/ml灌服，每日灌胃1次，持續(xù)給藥1周。于末次灌胃2 h后以4%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，通過腹主動脈取血，血液于37 ℃環(huán)境靜置2 h，待血液充分凝固后3000 r/min，10 min離心，將同組大鼠血清上清液收集到一起置于新的離心管，經(jīng)56 ℃水浴30 min滅活，一次性無菌過濾器將血清過濾除菌，并分裝于1.5 mL的凍存管中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng)

足細胞增殖階段培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)液中+10%胎牛血清+鏈霉素100μg/mL+青霉素100 U/mL+20U/ml(重組小鼠γ-干擾素)，置于33 ℃5%CO2培養(yǎng)箱，每2～3 d換液1次，待細胞呈鵝卵石樣、密度至85%左右用0.25%胰酶消化，后換成分化階段培養(yǎng)液，足細胞進入分化階段。

足細胞分化階段培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)液中+10%胎牛血清+鏈霉素100μg/mL+青霉素100 U/mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每2～3 d換液1次,10～14 d后分化成熟可用于實驗。

2.3 細胞分組

空白組：10%空白對照血清+DMEM培養(yǎng)基+鏈霉素100μg/mL+青霉素100 U/mL；替米沙坦組：10%替米沙坦血清+DMEM培養(yǎng)基+鏈霉素100 μg/mL+青霉素100 U/mL；加味黃芪赤風湯高、中、低劑量組(以下均簡稱中藥高、中、低劑量組)：分別以10%高、中、低劑量中藥血清+DMEM培養(yǎng)基+鏈霉素100 μg/mL+青霉素100 U/mL。取本次實驗前期所測ADR 2 μg/mL作為最佳損傷濃度用于實驗。阿霉素與治療藥物同時加入，作用24 h后檢測相關(guān)指標。

2.4 CCK-8法檢測各處理組足細胞存活率

取96孔板培養(yǎng)的分化成熟的足細胞，按上述細胞分組方法，每組6個復(fù)孔，每孔加入100 μl孵育液，孵育24 h(參考相關(guān)文獻，檢測時間點選擇24 h[7])用CCK-8法檢測各組足細胞存活率，經(jīng)酶標儀記錄各組450 nm吸光度值。

2.5 流式細胞儀檢測各處理組足細胞凋亡率

取6孔板培養(yǎng)的分化成熟足細胞，分組后用0.25%胰酶消化細胞收集細胞到EP管；將收集到的細胞重懸于1×Annexin Binding Buffer，使細胞密度不少于每100 μl有1×105個；加入5 μL AnnexinV-FITC及5 μL Propidium Iodide(PI)混勻、避光，25 ℃放置15 min；加入400 μl的1×Annexin Binding Buffer混勻，1 h內(nèi)用流式細胞儀進行檢測，F(xiàn)L1通道檢測AnnexinV，F(xiàn)L3通道檢測PI，以PI陰性、AnnexinV陽性為細胞凋亡判定標準。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限代表正常細胞，右下象限代表早期凋亡細胞，右上象限代表晚期凋亡及壞死的細胞，本次實驗統(tǒng)計的是右下象限早期凋亡細胞。

2.6 透射電鏡下觀察各處理組足細胞凋亡超微結(jié)構(gòu)

具體操作方法：細胞固定：5%戊二醛固定1～2 h后，0.1 mol/L PBS洗2次，每次15 min；1%餓酸固定1～2 h后用0.1 mol/L PBS洗2次，每次15 min，4℃；細胞脫水：用50%、70%、90%乙醇各脫水1次，每次20 min 4℃；100%乙醇與100%環(huán)氧丙烷(1∶1)脫水20 min 4℃；100%環(huán)氧丙烷脫水20 min 4℃；100%環(huán)氧丙烷脫水2次，每次20 min，室溫；細胞包埋：100%環(huán)氧丙烷與包埋液(2∶1)室溫處理4 h，100%乙醇與100%環(huán)氧丙烷(1∶1)室溫處理過夜，純包埋液37 ℃處理3 h；細胞固化：40 ℃ 2 h，60 ℃ 4 h，80 ℃ 10 h；超薄切片：鈾、鉛染色，分別15 min、10 min，鏡下觀察。

2.7 統(tǒng)計學方法

圖2 流式細胞儀檢測各組足細胞早期凋亡率變化

3 結(jié)果

3.1 各處理組對ADR誘導足細胞存活率的影響

表1圖1顯示，模型組與空白組比較，足細胞存活率明顯下降(P<0.01)，表明ADR能夠造成足細胞的嚴重損傷；中藥高、中劑量組及替米沙坦組與模型組比較，足細胞存活率均明顯上升(P<0.01)，3組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明加味黃芪赤風湯高、中劑量及替米沙坦均能夠拮抗ADR誘導的足細胞損傷；中藥低劑量組與模型組比較，足細胞存活率升高但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與中藥高、中劑量組比較，低劑量組足細胞存活率明顯下降(P<0.01)，表明加味黃芪赤風湯在拮抗ADR誘導的足細胞損傷中，可能具有一定的量效關(guān)系。

圖1 各處理組對ADR誘導的足細胞存活率比較注：與空白組比較:*P<0.01；與模型組比較:#P<0.01，##P>0.05

組別例數(shù)吸光度值空白組61.44±0.07模型組60.75±0.10*替米沙坦組61.19±0.02#中藥高劑量組61.20±0.02#中藥中劑量組61.18±0.03#中藥低劑量組60.84±0.05##

注：與空白組比較:*P<0.01；與模型組比較:#P<0.01，##P>0.05

3.2 各處理組足細胞凋亡情況比較

表2圖2顯示，EXPO32 v1.2軟件分析數(shù)據(jù)顯示，模型組與空白組比較足細胞早期凋亡率明顯上升(P<0.01)；中藥各組及替米沙坦組與模型組比較，足細胞早期凋亡率均明顯下降(P<0.01)；與替米沙坦組比較，中藥高、中劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與中藥高、中劑量組比較，低劑量組足細胞早期凋亡率明顯升高(P<0.01)。

表2 各處理組對ADR誘導足細胞早期凋亡的影響

注：與空白組比較:*P<0.01；與模型組比較:#P<0.01；與替米沙坦組比較:**P>0.05；與中藥高、中劑量比較:▲P<0.01

圖3 透射電鏡下各組足細胞凋亡超微結(jié)構(gòu)(20000×)

3.3 透射電鏡下各組足細胞凋亡超微結(jié)構(gòu)變化

圖3顯示，透射電鏡顯示，空白組足細胞胞體如常，細胞器較多，核仁清晰，核膜邊緣光滑、完整，核染色質(zhì)細膩、均勻地分布在核內(nèi)，未見凋亡小體、染色體邊集等凋亡結(jié)構(gòu)。模型組足細胞明顯皺縮，胞漿內(nèi)細胞器減少，染色質(zhì)邊集、凝聚成塊、核碎裂，形成凋亡小體。經(jīng)藥物干預(yù)后，各組足細胞凋亡改變可見不同程度的緩解。如替米沙坦組細胞皺縮，胞漿內(nèi)細胞器略減少，核仁清晰可見，核膜較厚、染色質(zhì)邊集；中藥高劑量組細胞略皺縮呈圓形，包漿內(nèi)細胞器略減少，核膜厚，染色質(zhì)固縮略有邊集；中藥中劑量組細胞皺縮呈圓形,胞漿內(nèi)細胞器減少,核膜厚，染色質(zhì)固縮邊集可見；中藥低劑量組細胞明顯皺縮呈圓形,核碎裂，染色質(zhì)凝聚成塊。

4 討論

張昱臨證診治CKD非常重視“氣虛證”“血瘀證”“風(邪)證”的辨識，認為氣虛、血瘀、風擾三者是CKD的基本病機，并確立了“益氣活血祛風”治法。據(jù)此法立方遣藥，研制出代表方加味黃芪赤風湯。黃芪赤風湯出自清代醫(yī)家王清任《醫(yī)林改錯》，其組方之旨與CKD的基本病機相合，故張昱將該方引入CKD的治療，在多年臨床研究基礎(chǔ)上，對其反復(fù)嘗試改進，形成目前行之有效的加味黃芪赤風湯。該方由生黃芪、防風、赤芍、穿山龍、芡實、金櫻子、白花蛇舌草組成。方中生黃芪、芡實、金櫻子益腎補脾、固攝精微，赤芍活血化瘀，穿山龍防風祛風、化濕、通絡(luò)兼有活血祛瘀之功，白花蛇舌草清熱解毒，全方共奏益氣活血、祛風解毒之功效。

足細胞損傷在蛋白尿的形成以及CKD進展中起重要作用。足細胞是構(gòu)成腎小球濾過膜的重要組成成分，具有生物合成、維持腎小球毛細血管結(jié)構(gòu)以及參與腎小球選擇性濾過等多種功能，其損傷是導致蛋白尿的重要原因。近年來，足細胞病變在腎小球疾病進展中的作用日益成為關(guān)注的焦點。近期研究發(fā)現(xiàn)，腎小球足細胞的損傷程度與CKD病情進展有密切關(guān)系，足細胞減少的程度與腎小球硬化及腎小球濾過率的下降密切相關(guān)，足細胞減少是CKD活動性的重要標志[8-9]。本研究表明，加味黃芪赤風湯可以拮抗ADR誘導足細胞存活率的下降，從而保護足細胞，減輕足細胞損傷。

凋亡是指細胞受到某些信號或刺激后，由特定基因調(diào)控而發(fā)生的一種主動性消亡過程。在正常情況下可以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，當有害物質(zhì)存在時則作為一種防御機制發(fā)揮作用。但是過度的凋亡則會引起細胞的Ⅰ型程序性死亡，從而破壞細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。研究表明，凋亡在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，對于腎臟疾病而言是一把“雙刃劍”。一方面，細胞凋亡可以清除浸潤的炎癥細胞和異常增殖的腎臟細胞，從而促進腎臟組織結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)[10-11]。另一方面，細胞凋亡可導致腎臟細胞的減少，加速腎小管萎縮和腎小球進行性硬化，從而加劇了腎臟病進程。本研究結(jié)果表明，在ADR誘導的腎小球足細胞損傷中，細胞凋亡呈現(xiàn)出高水平表達，表現(xiàn)為過度凋亡的狀態(tài)，從而加劇腎小球足細胞損傷[12]。而采用加味黃芪赤風湯干預(yù)后，足細胞凋亡水平下降，電鏡下足細胞損傷超微結(jié)構(gòu)也隨之改善。該研究提示，抑制足細胞過度凋亡可能是加味黃芪赤風湯發(fā)揮足細胞保護作用的一種內(nèi)在機制。

本研究僅檢測了加味黃芪赤風湯含藥血清對阿霉素誘導足細胞凋亡中早期凋亡的影響，而對其晚期凋亡及總凋亡的影響還有待于進一步的研究。

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