譜效關(guān)系分析在中藥組方研究中的應(yīng)用進(jìn)展?

馮 鑫，房德敏，周永梅

(天津市天津醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300211)

中藥復(fù)方制劑因藥味多、成分復(fù)雜、研發(fā)困難制約了其現(xiàn)代化和國際化的發(fā)展進(jìn)程。近年來，中藥譜效關(guān)系研究快速發(fā)展，它將中藥指紋圖譜和藥效學(xué)通過化學(xué)計(jì)量學(xué)模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)，建立了以化學(xué)分析與生物活性評價(jià)相結(jié)合的綜合評價(jià)體系，為揭示中藥方劑中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和配伍規(guī)律提供了有效手段。但譜效研究所選擇的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法和數(shù)據(jù)分析方法，是影響其結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的重要因素，故從方法設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和研究缺陷等方面闡述譜效關(guān)系在中藥組方中的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 方法設(shè)計(jì)

1.1 樣本選擇

樣本選擇是決定研究結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)，選擇具有代表性和說服力的研究樣本至關(guān)重要，一般常采用以下幾種方法篩選實(shí)驗(yàn)樣本。

1.1.1 拆方分析 也稱撤藥分析，是將組方藥味通過排列組合拆分成不同組并進(jìn)行組間差異研究。拆方研究的樣本確定方式不盡相同，可依據(jù)中醫(yī)組方原理，按照“君臣佐使”的順序逆向撤除使、佐、臣藥直至僅留君藥[1]，也可將方中各味排列組合，從單味、兩味、三味直至全方組合[2]；若是處方藥味稍多，可以采用單味方、缺單味方和全味方來確定研究樣本[3]，還有的是按研究側(cè)重點(diǎn)來確定藥味組合[4]。拆方研究只考慮方中藥味加減對藥效的影響，而未考慮藥量變化和提取工藝對藥效的影響。

1.1.2 統(tǒng)計(jì)篩選法 將統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)引入樣本篩選，既可顧及藥味加減對藥效的影響，還可兼顧藥量及提取工藝等因素的影響。良好的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)能夠恰當(dāng)選擇樣本量、嚴(yán)格控制誤差，充分顯示實(shí)驗(yàn)效應(yīng)，用低人力、物力和時(shí)間成本獲取滿意的結(jié)果。

(1)多因素設(shè)計(jì)采樣法：研究樣本受2個(gè)及以上因素影響時(shí)，需使用多因素設(shè)計(jì)采樣法。正交設(shè)計(jì)是研究多因素多水平的一種常用設(shè)計(jì)方法，是從全面實(shí)驗(yàn)中挑選出有代表性且具有“均勻分散，齊整可比”特點(diǎn)的點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可大大減少工作量，是一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。平胃散揮發(fā)油促胃排空作用的藥效物質(zhì)研究中，利用此法篩選不同組方、藥量、揮發(fā)油配比的研究樣本，探索促胃排空的主要起效組分[5]。劉廷等[6]也用此法篩選雙黃連口服液對抗甲型H1N1流感病毒對MDCK細(xì)胞損傷的組方樣本。

(2)拉丁超立方采樣法：該方法是抽樣技術(shù)的新發(fā)展，以分層采樣模式，用采樣值反映隨機(jī)變量的整體分布，保證所有采樣區(qū)均能被采樣點(diǎn)覆蓋。它可確保偏遠(yuǎn)事件也被有效涵蓋，使研究樣本更具有代表性和說服力，提高抽樣效率。在氣滯胃痛顆粒治療胃潰瘍和六味五靈片抗肝纖維化的譜效關(guān)系研究中，均是利用拉丁超立方采樣方法將組方中的藥味隨機(jī)抽樣成不同藥量配比的組方樣本進(jìn)行研究[7-8]。

1.1.3 篩選有效部位群 中藥方劑的物質(zhì)基礎(chǔ)具有整體性、綜合性和模糊性。有效部位群是中藥復(fù)方中化學(xué)類型明確、主成分清楚、含量達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的物質(zhì)群，是中藥方劑精制的基礎(chǔ)。在對中藥組方或配伍藥對進(jìn)行譜效關(guān)系分析時(shí)，篩選有效部位群作為研究樣本更具合理性。

篩選有效部位群應(yīng)采用遞進(jìn)式的研究模式。對有效部位群缺乏前期研究時(shí)，可先根據(jù)各藥味所含組分的物理化學(xué)特性進(jìn)行篩選。如利用系統(tǒng)溶劑法篩選二神丸在不同提取溶劑中的提取部位，初步確認(rèn)二神丸產(chǎn)生溫脾止瀉作用的是極性較小的化學(xué)組分[9]。在研究有一定前期積累時(shí)，則可針對之前的篩選結(jié)果進(jìn)行深入研究。如在確認(rèn)加味四妙丸組方中的揮發(fā)油、生物堿、皂苷、有機(jī)酸、糖類組合物是其有效部位群后，再將各有效部位提取物以不同方式組合，探討其共有峰的成分特征與藥效的相關(guān)性[10]；同樣，氣滯胃痛顆粒也是先確認(rèn)枳殼黃酮、檸檬烯、香附黃酮及香附揮發(fā)油是該藥的有效部位群，然后將這4種有效組分通過正交設(shè)計(jì)組合成不同的配方，研究各有效部位的藥效強(qiáng)弱及之間的交互作用，為該藥的質(zhì)控及機(jī)制研究提供理論依據(jù)[11]。

1.1.4 載藥血清 1988年日本首先提出中藥“血清藥理學(xué)”的新概念，因?yàn)橹兴幊煞謴?fù)雜，只有最終入血的成分才是中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，血中可能包含藥物原型、代謝物、組分間反應(yīng)形成的新成分，也可能是機(jī)體被刺激后產(chǎn)生的內(nèi)源物質(zhì)。這些組分以血液為媒介輸送到靶點(diǎn)發(fā)揮藥理作用，即載藥血清才是真正起效“制劑”[12]。選擇載藥血清做樣本需采集動物用藥后血液分離血清，用以替代藥物樣本進(jìn)行后續(xù)研究。在氣滯胃痛顆粒復(fù)方藥材的抗炎活性、復(fù)方五仁醇膠囊保肝作用以及芍藥-甘草復(fù)方效應(yīng)組分的譜效關(guān)系研究中，均是用載藥血清作為研究樣本[13-15]。

1.2 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法選擇

藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的選擇也尤為關(guān)鍵，中藥藥效學(xué)研究應(yīng)遵循中醫(yī)藥理論，選與中醫(yī)“證”或“病”相符或相近的動物模型或?qū)嶒?yàn)方法。若觀測藥物直觀療效，常選用動物模型或離體器官；若研究作用機(jī)制則一般選用細(xì)胞培養(yǎng)和生化實(shí)驗(yàn)。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)選特異性強(qiáng)、敏感性高、重現(xiàn)性好的指標(biāo)。

1.2.1 在體實(shí)驗(yàn)及動物模型選擇 中藥因藥效物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜，“同癥不同病，同病不同癥”的現(xiàn)象屢見不鮮。藥效數(shù)據(jù)的可靠性及準(zhǔn)確性直接關(guān)系到研究結(jié)果的可信度，故研究者應(yīng)根據(jù)藥物的已知功效特點(diǎn)、作用機(jī)制及研究條件選擇最適宜的方法和指標(biāo)。

氣滯胃痛顆粒促胃腸動力研究中，選擇小鼠胃腸動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，采用半固體碳末糊推進(jìn)法和全胃腸道推進(jìn)運(yùn)動2種方法，以胃內(nèi)容物殘留率、碳末在胃腸道全長中的占比，及首次碳末便的排便時(shí)間為觀測指標(biāo)；同時(shí)將與胃腸動力密切相關(guān)的NO、cGMP和Ca2+含量等生化指標(biāo)作為另一組評價(jià)指標(biāo)，以在體實(shí)驗(yàn)與生化檢測相結(jié)合的方法評定藥效[11]。同樣是胃排空試驗(yàn)，平胃散揮發(fā)油的促胃排空作用則選擇大鼠灌服含藥牛奶和锝，用SPECT觀測不同時(shí)段大鼠胃內(nèi)锝殘留量，通過線性擬合所得的全胃半數(shù)胃排空時(shí)間為藥效評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行譜效關(guān)系研究[5]。

心肌缺血治療藥劑的譜效關(guān)系研究所采用的實(shí)驗(yàn)方法及觀測指標(biāo)也不盡相同。當(dāng)歸-川芎配伍紅花提取物的研究中，采用結(jié)扎大鼠冠狀動脈誘發(fā)急性心肌缺血的模型，以心肌梗死率及血清LDH水平的下降為觀察指標(biāo)[16]。栝樓薤白滴丸是用小鼠灌藥第7天肌注異丙腎上腺素10 mg·kg-1的方式造模，以血漿CK含量作為藥效指標(biāo)[17]。

在痛經(jīng)治療藥物的研究中，陳永剛等[1]選擇急性血瘀證大鼠模型，以血漿黏度、全血黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞壓積、血沉方程K值及紅細(xì)胞電泳指數(shù)等作為觀測指標(biāo)，闡釋生化湯溫經(jīng)止痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及配伍原理。桃紅四物湯則選用已烯雌酚增敏后的小鼠，使用催產(chǎn)素來建立痛經(jīng)模型，以扭體次數(shù)為觀測指標(biāo)[18]。吳茱萸-當(dāng)歸藥對的研究中，選用的是縮宮素所致大鼠子宮平滑肌條收縮試驗(yàn)[19]。

1.2.2 體外藥效實(shí)驗(yàn)選擇 當(dāng)在體實(shí)驗(yàn)及動物模型選擇困難，或難以得到滿意的藥效學(xué)量化數(shù)據(jù)時(shí)，可考慮選擇體外藥效實(shí)驗(yàn)，如：實(shí)驗(yàn)室檢測法、細(xì)胞病變效應(yīng)法等。療效評價(jià)指標(biāo)的選擇，必須采用已被證實(shí)且公認(rèn)，與藥效作用機(jī)制密切相關(guān)的指標(biāo)。

(1)實(shí)驗(yàn)室檢測法：藏方甲嘎松湯揮發(fā)油體外抗氧化活性研究中，選擇DPPH和ABTS兩個(gè)自由基清除實(shí)驗(yàn)，通過測定不同批次揮發(fā)油與工作液反應(yīng)后的吸光度變化，考察其揮發(fā)油對兩種自由基的綜合清除能力[20]。在參芪通脈益智方提取工藝評價(jià)中，也是選擇DPPH體外抗氧化實(shí)驗(yàn)作為老年癡呆性疾病的療效評價(jià)方法[21]。

(2)細(xì)胞病變效應(yīng)法：氣滯胃痛顆粒治療胃潰瘍的研究中，以8%無水乙醇制造人胃黏膜上皮細(xì)胞損傷模型，以細(xì)胞增殖率、SOD增殖率和MDA抑制率作為體外藥效學(xué)指標(biāo)[7]。在對該藥復(fù)方藥材抗炎活性的研究中，通過測定不同配比組方對LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7所釋放炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和NO)的抑制率[13]，以對比不同組方的抗炎效果。

雙黃連對抗H1N1流感病毒的研究中，以感染H1N1病毒后MDCK細(xì)胞的存活率為評價(jià)指標(biāo)，評價(jià)不同配方的抗病毒作用[6]。六味五靈片抗肝纖維化研究是將與肝纖維化密切相關(guān)的LX-2肝星狀細(xì)胞的增殖抑制率作為療效指標(biāo)，評價(jià)不同提取物的抗肝纖維化效果[8]。

2 數(shù)據(jù)分析方法

2.1 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析是對兩個(gè)或多個(gè)具備相關(guān)性的變量元素進(jìn)行分析，衡量變量因素間的相關(guān)程度[22]。中藥譜效研究主要是分析中藥指紋圖譜與療效兩變量間的關(guān)系，故常使用雙變量相關(guān)性分析(BCA)。因研究多以連續(xù)變量為主，故一般比較的是皮爾遜相關(guān)系數(shù)。

芍藥-甘草解痙活性成分研究，采用BCA法確定與解痙作用相關(guān)的藥效組分峰[14]。白虎湯的抗炎譜效研究同樣用該法證明了知母是白虎湯抗炎作用中最重要的藥材[1]。在烏頭湯抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與療效關(guān)系研究中，利用BCA證實(shí)烏頭湯優(yōu)選方配伍的規(guī)律性和組方的合理性[4]。

2.2 灰色關(guān)聯(lián)分析(GRA)

灰色系統(tǒng)理論是20世紀(jì)80年代由鄧聚龍?zhí)岢霾?chuàng)立的一門新興學(xué)科，它以部分信息已知、部分信息未知的小樣本、貧信息、不確定性系統(tǒng)為研究對象，通過對已知信息的生成、開發(fā)來提取有價(jià)值的信息，實(shí)現(xiàn)對系統(tǒng)運(yùn)行及演化規(guī)律的正確描述和有效監(jiān)控。一般中藥的組分缺失信息多，很適合運(yùn)用灰色系統(tǒng)理論來研究。

GRA是根據(jù)灰色系統(tǒng)中各因素間發(fā)展趨勢的相似或相異程度來衡量因素間關(guān)聯(lián)程度的一種方法。若系統(tǒng)中兩個(gè)因素同步化程度高，說明二者關(guān)聯(lián)度較高，反之則較低。近年在對中藥復(fù)方有效成分、有效提取部位及提取工藝等研究中，GRA的應(yīng)用日益增多。在二神丸溫脾止瀉、參芪通脈益智方的體外抗氧化活性、補(bǔ)中益氣丸的補(bǔ)血作用、黃芪-葛根藥對保護(hù)胃黏膜損傷等多項(xiàng)研究中，均運(yùn)用GRA法分別得出各組方成分對藥效貢獻(xiàn)的大小順序[9,21-24]。

GRA不但可以確定中藥各組分與藥效貢獻(xiàn)的大小，還可以根據(jù)關(guān)聯(lián)度確定有效物質(zhì)群及多成分間的相互作用。這在栝樓薤白滴丸抗心肌缺血研究、縮泉丸縮尿作用研究以及神香草體外抗炎活性等研究中均有所體現(xiàn)[17,25-26]。以GRA解析逍遙方3 種不同制備工藝與疏肝解郁療效間的關(guān)系，在證實(shí)該方為組分間協(xié)同起效的同時(shí)，還確認(rèn)了新制劑工藝的合理性[27]。

2.3 正交投影偏最小二乘法(OPLS)

偏最小二乘回歸分析(PLS)是1983年由伍德等提出的，它是一種多因變量對多自變量的新型多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析方法，集合了多元線性回歸分析(MLR)、典型相關(guān)分析(BCA)和主成分分析(PCA)等方法的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了多種數(shù)據(jù)分析方法的綜合應(yīng)用，具有計(jì)算量小、預(yù)測精度高、無需剔除樣本、易于定性解釋等優(yōu)點(diǎn)[28]。

OPLS是改良后的偏最小二乘法，能夠有效去除預(yù)測矩陣中與因變量無關(guān)的信息，改善模型的真實(shí)性及解釋性，較適用于摸索中藥復(fù)方中復(fù)雜的活性成分群，以解釋中藥復(fù)方制劑多成分協(xié)同的作用。在研究當(dāng)歸四逆湯凝血作用時(shí)，通過OPLS分析，根據(jù)各藥材變異權(quán)重參數(shù)值總和的大小，確定了對延長凝血酶時(shí)間貢獻(xiàn)較大的色譜峰，經(jīng)歸屬確認(rèn)后，確定對延長凝血酶時(shí)間貢獻(xiàn)較大的藥材依次為當(dāng)歸、桂枝、甘草、白芍[3]。

2.4 綜合分析法

表1顯示，中藥譜效關(guān)系研究中，使用單一統(tǒng)計(jì)分析方法往往不能反映真實(shí)的譜效關(guān)系結(jié)果，因此多數(shù)研究會采用多種統(tǒng)計(jì)方法相佐證的綜合分析方法。

2.4.1 BCA+ 多元回歸分析(MLR) BCA是研究變量間的密切程度，關(guān)系越密切相關(guān)系數(shù)越大。MLR是研究多個(gè)自變量與一個(gè)因變量之間是否存在某種線性或非線性關(guān)系的統(tǒng)計(jì)方法，可定量描述自變量對因變量的貢獻(xiàn)率，回歸系數(shù)越大影響越大。在中藥譜效關(guān)系分析中，BCA+MLR是采用較多的綜合分析方法。

強(qiáng)迫引入法(Enter)和逐步回歸法(Stepwise)是MLA常用的2種方法。Enter是將所有自變量一次性引入并進(jìn)行分析，同時(shí)考察各因素的作用。Stepwise是按各因素的貢獻(xiàn)由大到小依次引入自變量，每引入一個(gè)自變量就對其進(jìn)行顯著性分析，直至將所有具有顯著影響的因素全部引入。瀉白散祛痰、抗炎作用和梔子厚樸湯抗抑郁作用的研究使用的是BCA+ Enter分析法[29-30]，而桃紅四物湯治療痛經(jīng)的研究則選用BCA+ Stepwise的方法[18]。

Enter 與 Stepwise 也各有缺陷。由于Enter分析同時(shí)引入的自變量較多，可能會使各因素的影響變小，掩蓋主要作用因素，使其不能通過顯著性檢驗(yàn)；而Stepwise可對各變量進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，但不能同時(shí)分析各因素的作用，兩種方法具有互補(bǔ)性，因此有些研究也會同時(shí)采用Enter 和Stepwise 進(jìn)行多元回歸分析。如加味四妙丸有效部位群和柴胡-黃芩藥對保肝作用有效部位的研究均采用BCA+ Enter/Stepwise的分析方法[10,31-32]。

2.4.2 BCA+GRA BCA明確反映兩變量間的相關(guān)程度與方向，GRA是通過研究已知信息來揭示未知信息，兩種分析方法互補(bǔ)，既可相互驗(yàn)證又可以發(fā)現(xiàn)研究的缺陷與不足，揭示出新的研究突破點(diǎn)。利用該方法已確證藏方甲嘎松湯揮發(fā)油體外抗氧化作用的排序[20]，也指出復(fù)方大承氣湯的主要藥效組分，并非以往研究所認(rèn)定的指標(biāo)性成分，為該藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提出了新的思路和突破口[33]。

2.4.3 主成分分析(PCA)+ BCA PCA是一種降維統(tǒng)計(jì)方法，利用數(shù)學(xué)變換將許多相關(guān)性很高的變量轉(zhuǎn)化成彼此相互獨(dú)立或不相關(guān)的變量，選出比原始變量個(gè)數(shù)少，但能解釋大部分變量的幾個(gè)新變量，即所謂主成分，以解釋資料的綜合性指標(biāo)。BCA與PCA的分析思路均是篩選出少量具有代表性的指標(biāo)，其不同在于BCA篩除的是信息冗余指標(biāo)，使評價(jià)體系簡潔明快，PCA篩除的是對評價(jià)結(jié)果影響較小的指標(biāo)，保留重要指標(biāo)。六味五靈片抗肝纖維化作用的譜效研究就選擇了該方法[8]。

2.4.4 GRA+ BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是按誤差逆向傳播算法訓(xùn)練的多層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，也是目前應(yīng)用最廣的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)具有輸入層、隱藏層和輸出層，其基本思想是梯度下降，利用梯度搜索技術(shù)使網(wǎng)絡(luò)的實(shí)際輸出值和期望輸出值的誤差均方差為最小。經(jīng)過訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能對類似樣本的輸入信息自行處理，輸出誤差最小的經(jīng)非線形轉(zhuǎn)換的信息。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)突出優(yōu)點(diǎn)是具有很強(qiáng)的非線性映射能力和柔性的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。網(wǎng)絡(luò)的中間層數(shù)、各層神經(jīng)元個(gè)數(shù)可根據(jù)具體情況任意設(shè)定，并隨結(jié)構(gòu)的差異使其性能也有所不同。氣滯胃痛顆粒的譜效研究多采用GRA+ BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法[7,11,13]。

2.4.5 GRA+ BCA+ MLR 在GRA與BCA相互驗(yàn)證，中藥復(fù)方譜-效相關(guān)程度的基礎(chǔ)之上，可再配合MLR進(jìn)一步確認(rèn)組分對藥效的貢獻(xiàn)大小。逍遙散乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物抗抑郁譜效關(guān)系的研究即選用了該方法[34]。

表1中藥組方譜效關(guān)系研究中使用的綜合分析方法

Table 1 Comprehensive analysis method used in the study of spectrum effect relationshipof Chinese herbal prescription

綜合分析方法組方藥效研究結(jié)果參考文獻(xiàn)BCA+MLRBCA+Enter瀉白散祛痰、抗炎桑白皮為方中君藥,有2種成分與藥效正相關(guān)[29]梔子厚樸湯抗抑郁主要活性成分為和厚樸酚與厚樸酚,多組分協(xié)同起效[30]BCA+Stepwise桃紅四物湯治療痛經(jīng)石油醚部位為主要有效提取部位,主要起效成分為亞油酸,十八碳烯酸、花生酸和二十七烷協(xié)同起效[18]BCA+Enter/Stepwise加味四妙丸抗痛風(fēng)揮發(fā)油部位的大部分成分是主要藥效部位[10,31]柴胡-黃芩藥對保肝黃芩某一原形組分和一種體內(nèi)代謝產(chǎn)物有明顯藥效[32]BCA+GRA藏方甲嘎松湯體外抗氧化揮發(fā)油組分整體協(xié)同起效,并確定了起效成分的排序[20]大承氣湯除身熱蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚等為方中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),可作為質(zhì)控及工藝優(yōu)化評價(jià)指標(biāo);除橙皮苷、蘆薈大黃素和厚樸酚外,大部分關(guān)聯(lián)度大的色譜峰尚無歸屬[33]PCA+BCA六味五靈片抗肝纖維化多成分間協(xié)同起效[8]GRA+BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)氣滯胃痛顆粒促胃腸動力建立預(yù)測模型,誤差絕對值<6.83%[7]抗?jié)兘㈩A(yù)測模型,誤差絕對值<8.16%[11]抗炎建立預(yù)測模型,誤差絕對值<7%[13]GRA+BCA+MLR逍遙散抗抑郁柴胡為君藥,柴胡皂苷為主要藥效成分,柴胡皂苷D、E、G與該藥醇提物的乙酸乙酯萃取物抗抑郁藥效關(guān)系最大[34]PCA+Hierarchical聚類分析+BCA+MLR逍遙散抗抑郁證實(shí)柴胡、當(dāng)歸為君藥,白術(shù)為臣藥[35]主要起效成分是低極性組分[36]

2.4.6 PCA+ Hierarchical聚類分析+ BCA+ MLR Hierarchical聚類分析是驗(yàn)證PCA結(jié)果的一種分析方法。它將n個(gè)記錄或變量看成是一類，根據(jù)接近程度將最相近的兩類合并形成n-1類；在n-1類中重新計(jì)算變量間的距離再進(jìn)行合并，直到所有記錄合并為一類。在譜效研究中，可先采用PCA篩選出主要藥效組分，再用聚類分析加以驗(yàn)證，最后用BCA和MLR法進(jìn)行綜合評價(jià)。該方法在逍遙散有效化學(xué)組分及有效部位最佳配伍篩選研究中得到運(yùn)用[35-36]。

3 研究缺陷分析

3.1 研究樣本選擇

中藥進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)吸收、分布、代謝后起效，起效成分有可能是中藥固有成分、代謝產(chǎn)物、組分間相互作用產(chǎn)物，甚至是藥物所激發(fā)的內(nèi)源性物質(zhì)。若血中移形成分大部分為中藥固有成分，可選藥物作為研究樣本；但若非固有成分多，則應(yīng)考慮選用載藥血清作研究樣本。但載藥血清也存在諸多問題，一是 進(jìn)行組方配伍及有效組分篩選時(shí)研究組別多、動物數(shù)量大、成本高；二是樣本前處理相對復(fù)雜，易造成成分的流失；三是采血量大，不適于用體型過小的動物；四是需要多次采血，對動物的影響不好評估；五是高成本導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不易重復(fù)。

3.2 圖譜信息的完整性和精確性

3.2.1 完整性 中藥化學(xué)組分繁雜，單張圖譜難以完整反映所有化學(xué)特征，若根據(jù)單張圖譜進(jìn)行譜效關(guān)系研究，雖可簡化問題，但會出現(xiàn)譜效不對應(yīng)的情況，故研究應(yīng)綜合多種圖譜分析結(jié)果，建立多源融合指紋圖譜。盡管如此，圖譜中仍然會存在信息的缺失，除儀器分析方法造成的缺失外，樣本本身也會存在信息的缺失。藥物圖譜中缺少體內(nèi)移形或代謝后的組分信息；而血清圖譜則可能缺少藥物中低含量有效組分的圖譜信息。

3.2.2 精確性 圖譜識別一般需經(jīng)過樣品識別、譜峰識別、譜峰對齊和譜峰標(biāo)準(zhǔn)化4個(gè)步驟，必要時(shí)還需手工調(diào)整才能完成譜圖的優(yōu)化與編輯[37]。國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”軟件可被用以協(xié)助研究者完成圖譜識別處理。精準(zhǔn)的圖譜識別是分析方劑中化學(xué)成分歸屬、明確有效成分的關(guān)鍵，如果發(fā)生偏差譜效分析將失去立足之本。在現(xiàn)階段，中藥組分識別研究仍是一項(xiàng)十分艱巨和浩大的工程。

3.3 藥效模型選擇

中醫(yī)診療中“病、證不統(tǒng)一”的現(xiàn)象屢見不鮮，厘清組方方解，對準(zhǔn)確選擇藥效模型尤為關(guān)鍵。鑒于組方多是多方面、多途徑共同起效，所以一般采用在體試驗(yàn)為主，配合體外試驗(yàn)的方式。即便如此，由于目前藥效研究更依賴于化藥的藥效模型，并不能充分、完整地反映中藥的臨床功效。另外功效與療效的量化指標(biāo)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，這也是中藥譜效研究的缺陷之一。

3.4 數(shù)據(jù)分析方法的限制

每種統(tǒng)計(jì)方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，均不能完美闡釋中藥的譜效關(guān)系，應(yīng)采用多種統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行綜合分析。但目前譜效研究對統(tǒng)計(jì)分析方法的選擇缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同統(tǒng)計(jì)方法得出的分析結(jié)果還可能存在較大差異。在本文所查閱的諸多文獻(xiàn)中，只有藏方甲嘎松湯揮發(fā)油體外抗氧化活性的譜效研究1篇文獻(xiàn)用兩種統(tǒng)計(jì)方法所得結(jié)果一致，其余采用綜合分析法的文獻(xiàn)均報(bào)道有差異。由此可見，只有建立起譜效關(guān)系研究中數(shù)據(jù)分析方法的選擇標(biāo)準(zhǔn)，才能保證中藥譜效關(guān)系研究的準(zhǔn)確性，更進(jìn)一步推動中藥譜效研究的發(fā)展進(jìn)程。

4 展望

植根于中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的復(fù)方中藥，其藥味間以“君臣佐使”相互制約、相互協(xié)調(diào)而發(fā)揮藥效。中藥內(nèi)在質(zhì)量、藥效特性、組方配伍不能僅用一種或幾種化學(xué)活性成分的變化來闡釋。盡管中藥譜效關(guān)系研究還存在諸多缺陷，但不可否認(rèn)通過中藥譜效相關(guān)性的研究，可以揭示復(fù)方中藥的配伍規(guī)律，篩選有效部位群、表征藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步闡明中藥藥效作用機(jī)制、遴選最佳制備工藝、推動復(fù)方中藥的國際化進(jìn)程提供新的研究導(dǎo)向及途徑。

當(dāng)今科技已步入智能大數(shù)據(jù)時(shí)代，中藥的國際化之路需要充分利用互聯(lián)網(wǎng)優(yōu)勢，將大數(shù)據(jù)信息引入中藥臨床和中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展中[38]。近年來，已有學(xué)者投身于中藥指紋圖譜大數(shù)據(jù)軟件的研制開發(fā)，如中藥圖譜文件云服務(wù)PaaS模型設(shè)計(jì)，可解決云計(jì)算環(huán)境下中藥圖譜數(shù)據(jù)挖掘過程中難以解決的大數(shù)據(jù)傳輸效率問題，為圖譜分析系統(tǒng)向云計(jì)算環(huán)境改造提供高效、安全的解決方案[39]。關(guān)于復(fù)雜體系及儀器大數(shù)據(jù)分析的化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件ChemPattern的研制應(yīng)用，不但可以通過標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)接口技術(shù)實(shí)現(xiàn)對各類高維、高分辨海量數(shù)據(jù)的信號處理，還可以用高性能并行計(jì)算和大規(guī)模數(shù)據(jù)可視化技術(shù)為眾多化學(xué)計(jì)量學(xué)應(yīng)用提供支持[40]。智能化分析軟件的開發(fā)應(yīng)用必然會進(jìn)一步推動中藥譜效關(guān)系研究的發(fā)展，成為該領(lǐng)域研發(fā)的最佳助力。

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