幾種飲品中水溶性糖的HPLC-ELSD 法檢測(cè)

蘆廣銀 ，吳福芳 ，朱 靜 ，馬擴(kuò)彥 ，戴 亞 ，盛良全 *

（1.阜陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 2360370；2.重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)研發(fā)中心,重慶 400060）

市場(chǎng)上飲品種類(lèi)繁多,有茶飲品、碳酸飲品、果汁飲品、乳酸菌飲品和飲品酒等，大部分飲品只標(biāo)注了碳水化合物的總含量，未具體標(biāo)注碳水化合物的種類(lèi)和含量。飲品中的水溶性糖主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖[1-3]，其中蔗糖含量比較高，蔗糖攝入過(guò)量會(huì)導(dǎo)致齲齒、肥胖等疾病[4-6]，對(duì)人類(lèi)生活造成一定的威脅，尤其是老年人和特殊人群[7]。因此，找到快捷、簡(jiǎn)單并能廣泛應(yīng)用的飲品中水溶性糖的測(cè)定方法十分必要。

水溶性糖的測(cè)定方法有化學(xué)法、酶比色法、酶電極法、毛細(xì)管電泳法[8]和高效液相色譜法等[9-12]?；瘜W(xué)法[13]一般用于還原糖和總糖的測(cè)定[14-15]，操作復(fù)雜，無(wú)針對(duì)性，通常采用堿性酒石酸銅直接滴定法和高錳酸鉀滴定法，均利用糖的還原性，籠統(tǒng)地以還原糖或總糖表示結(jié)果，無(wú)法測(cè)定各種糖的具體含量[16]；酶比色法、酶電極法[17-18]是一種只針對(duì)葡萄糖分析方法，測(cè)定蔗糖要用β-果糖苷酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖后測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果受酶純度及酶活性的影響[19]；HPLC-ELSD法可同時(shí)測(cè)定多種糖，方法簡(jiǎn)單可靠、靈敏度高、重現(xiàn)性好、應(yīng)用范圍廣[20-22]，其優(yōu)點(diǎn)源于采用了ELSD；ELSD是一種通用型質(zhì)量檢測(cè)器，基于不揮發(fā)的樣品顆粒對(duì)光的散射程度與其質(zhì)量成正比進(jìn)行測(cè)定，對(duì)沒(méi)有紫外吸收、熒光或電活性的物質(zhì)均能產(chǎn)生響應(yīng)[23]；穩(wěn)定性好，靈敏度高，無(wú)溶劑峰干擾，彌補(bǔ)了HPLC傳統(tǒng)檢測(cè)器的不足[24]；與熒光檢測(cè)器相比，應(yīng)用范圍更廣；與示差檢測(cè)器相比，避免了對(duì)工作環(huán)境、流速、溫度的苛刻要求和無(wú)法進(jìn)行梯度洗脫的局限性[25]。本實(shí)驗(yàn)研究采用HPLC-ELSD法測(cè)定飲品中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖等水溶性糖含量。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

材料：冰紅茶、可樂(lè)、鮮果橙、小洋人乳酸菌飲料和干紅葡萄酒（法國(guó)卡斯特兄弟股份有限公司）。

試劑：L-（+）-鼠李糖（BR，上海展云化工有限公司）；D（+）-木糖（BR，上海展云化工有限公司）；D-果糖（GR，上海試劑二廠）；D-甘露糖（AR，公私合營(yíng)恒信化工廠）；D-葡萄糖（AR，北京化工廠）；蔗糖（GR，國(guó)營(yíng)上海試劑廠）；乳糖(AR，廣州仁人制藥廠；乙酸鋅（CP，洛陽(yáng)化學(xué)試劑廠）；冰醋酸（AR，上海強(qiáng)順化學(xué)試劑廠）；亞鐵氰化鉀（CP，北京紅星化工廠）；乙腈(色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?；甲醇（色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司）；高純氮（99.99%，純N2）（合肥眾益化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司）。

儀器：YL9100高效液相色譜（HPLC），YL9180蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD）（南昌捷島科學(xué)儀器有限公司）；J-K100DB型數(shù)控超聲波清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）；0.45 μm水系微孔濾膜。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

碳酸飲品處理方法：冰紅茶、可樂(lè)、鮮果橙分別取2.00 mL至100.00 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻。用0.45 μm濾膜將樣液過(guò)濾后，取樣20 μL進(jìn)行色譜分析，（其中可樂(lè)要經(jīng)過(guò)超聲振蕩半小時(shí)）；紅酒取10.00 mL至100.00 mL容量瓶中，方法同上。

乳酸菌飲品處理方法：準(zhǔn)確吸取某品牌小洋人乳酸菌飲品2.00 mL至100.00 mL容量瓶中，加20 mL水并緩慢加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各2.00 mL，加水定容至刻度，混勻，靜置30 min，用干燥濾紙過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm 濾膜，取樣 20 μL進(jìn)行色譜分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)量0.200 0 g(精確至0.000 1 g)經(jīng)干燥至恒重的鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，再分別準(zhǔn)確稱(chēng)量0.040 0 g、0.080 0 g、0.120 0 g經(jīng)干燥至恒重的木糖、果糖、甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品，分別溶解于50 mL燒杯中，后轉(zhuǎn)移至100.00 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻即得糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存。分別吸取不同體積的上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于不同規(guī)格的容量瓶中，配置成不同濃度的溶液，搖勻即得一系列糖標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：糖分析柱Zorbax Carbohydrate（4.6 mm × 250 mm，5 μm），（南昌捷島科學(xué)儀器有限公司）；流動(dòng)相∶乙腈/水（77/23，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫為：25℃；漂移管溫度60℃；ELSD Spray Chamber溫度為30℃；氮?dú)鈮毫?.5 Mpa;進(jìn)樣20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

同1.2.3方法，改變流動(dòng)相，其它條件不變，分別在乙腈-水溶液體積比為 75∶25、77∶23、80∶20進(jìn)樣20 μL檢測(cè)分析各組分糖的分離情況，見(jiàn)表1。結(jié)果表明，水在流動(dòng)相中的比例減小，被測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間延長(zhǎng)，分離度有一定提高，分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致峰形展寬；當(dāng)乙腈和水的比例為75∶25時(shí)，木糖和果糖的峰部分重疊，葡萄糖和甘露糖的峰部分重疊，分離效果不佳，當(dāng)比例為77∶23時(shí)，所有的糖基本都已分開(kāi)，且峰形比較好，繼續(xù)降低水的比例分離度增大，分離時(shí)間延長(zhǎng)，峰形展寬嚴(yán)重。因此，選擇乙腈和水的比例為77∶23(V/V)進(jìn)行分析。

2.1.2 流速的選擇

同1.2.3方法，改變流速，其它條件不變，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，提高流速，被測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間縮短，分離度下降，當(dāng)流速為1.2 mL/min時(shí)，木糖和果糖的峰部分重疊，分離效果不佳，繼續(xù)降低流速，分離度有一定提高，分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，峰形展寬嚴(yán)重。因此，選擇流速為1.0 mL/min進(jìn)行分析。

2.1.3 柱溫的選擇

同1.2.3方法，改變柱溫，其它條件不變，見(jiàn)表3。結(jié)果表明，分離時(shí)間和分離度受柱溫影響不大。因此，選擇室溫即25oC條件進(jìn)行分析。

2.1.4 ELSD參數(shù)的選擇

根據(jù)吳福芳等的《HPLC-ELSD法檢測(cè)煙草秸稈中水溶性糖》文章[26]設(shè)置ELSD參數(shù)，以推薦值為起點(diǎn)，逐漸改變漂移管溫度或載氣流速，觀察基線(xiàn)噪音和響應(yīng)信號(hào)的大小。結(jié)果表明，當(dāng)漂移管溫度為60℃，ELSD Spray Chamber溫度為30℃，氮?dú)鈮毫?.5 Mpa，分流閥開(kāi)時(shí)，噪音最小，響應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)，故確定此條件為最佳條件。

表1 不同流動(dòng)相下各組分糖的分離度

表2 不同流速下各組分糖的分離度

表3 不同柱溫下各組分糖的分離度

2.2 樣品測(cè)定

2.2.1 7種水溶性糖的HPLC分析

同1.2.3方法，取混有7種水溶性糖的樣液20 μL進(jìn)樣分析，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明7種水溶性糖在此色譜條件下，基本分離，分離時(shí)間不超過(guò)20 min，峰形窄且對(duì)稱(chēng)，分離效果好。

2.2.2 線(xiàn)性范圍和檢出限

同1.2.3方法，取系列標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，即可得到7種水溶性糖的回歸方程；根據(jù)公式檢出限=3倍儀器噪聲信號(hào)÷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程斜率，測(cè)定7種水溶性糖檢出限，見(jiàn)表4。結(jié)果表明果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖在10.00～2 100.00 mg/L范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系，檢出限在3.00～9.00 mg/L范圍內(nèi)。

圖1 7種水溶性糖混合標(biāo)準(zhǔn)液的HPLC-ELSD色譜圖

表4 7種水溶性糖類(lèi)化合物的回歸方程

表5 樣品7種水溶性糖的含量/mg/mL

2.2.3 樣品水溶性糖含量

同1.2.3方法，分別取5種處理好的飲品樣液20 μL進(jìn)樣分析，并根據(jù)線(xiàn)性回歸方程求得樣品中水溶性糖含量，見(jiàn)表5。

結(jié)果表明，在所測(cè)得5種飲品中都不含有鼠李糖和木糖，但都含有果糖和葡萄糖；采用HPLCELSD法檢測(cè)飲品中各水溶性糖總含量和飲品商標(biāo)提供的碳水化合物含量一致，如某品牌冰紅茶中總糖濃度約為93.75 mg/mL，紅酒的含糖量小于4 mg/mL等；鮮果橙和冰紅茶中蔗糖含量較高，干紅葡萄酒中總糖含量很少，為人們對(duì)飲品中糖攝取量的關(guān)注提供了一定的參考。

2.2.4 精密度和方法穩(wěn)定性

同1.2.3方法，取處理好的鮮果橙樣液20 μL進(jìn)樣分析，平行測(cè)定6次。根據(jù)果糖、葡萄糖、蔗糖的峰面積計(jì)算其含量，求得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.621%、0.239%和0.641%，RSD均小于1%。結(jié)果表明該方法精密度良好；取同一鮮果橙樣品溶液，每隔2 h進(jìn)樣分析1次，分別測(cè)得一天內(nèi)果糖、葡萄糖、蔗糖的含量變化，得到果糖、葡萄糖、蔗糖含量變化的RSD分別為3.251%、6.254%、0.789%。結(jié)果表明飲品中葡萄糖和果糖濃度隨時(shí)間變化比較大，為了不影響樣品中水溶性糖含量的測(cè)定，處理好的樣品最好在2 h內(nèi)進(jìn)樣檢測(cè)分析。

2.2.5 回收率

在已知糖含量的鮮果橙樣品中分別加入一定量的鼠李糖、木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖，按1.2.1方法處理成待測(cè)溶液，取樣液20 μL進(jìn)樣分析，平行測(cè)定3次，按照外標(biāo)法定量并根據(jù)公式回收率＝（加標(biāo)試樣測(cè)定值―試樣測(cè)定值）÷加標(biāo)量×100%計(jì)算其回收率，見(jiàn)表6。結(jié)果表明7種糖的回收率均在73.1%～114.8%范圍內(nèi)。

表6 樣品加標(biāo)回收率

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)研究采用HPLC-ELSD法檢測(cè)幾種常見(jiàn)飲品中水溶性糖含量，測(cè)得飲品總糖含量和飲品商標(biāo)提供的碳水化合物含量一致，幾種水溶性糖的回收率均在73.1%～114.8%范圍之內(nèi)，精密度小于1%，檢出限在3.00～9.00 mg/L范圍，與傳統(tǒng)檢測(cè)水溶性糖的方法相比，該法具有靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好以及無(wú)其它雜質(zhì)干擾、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，從而建立了一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏測(cè)定飲品中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖等水溶性糖含量的HPLC-ELSD檢測(cè)方法，為人們對(duì)飲品中各種糖的攝取量提供一定的參考。

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