薏苡附子敗醬散對糖尿病小鼠炎癥因子及腸道菌群的影響

陳玲玲，張思為，李董平，陳伊莉

廣東省深圳市人民醫(yī)院中醫(yī)科(深圳518020)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是最常見的代謝疾病之一，嚴(yán)重危害身體的器官尤其是腎臟、眼睛、心臟和神經(jīng)[1]，已成為全球性公共衛(wèi)生問題。開發(fā)T2DM的新的治療藥物具有重大的意義。近年來研究表明糖尿病、肥胖等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群特別是雙歧桿菌、乳酸桿菌等密切相關(guān)，調(diào)節(jié)腸道菌群的分布能夠抑制T2DM患者的炎癥表達(dá)，降低血糖發(fā)揮治療作用[2-5]。薏苡附子敗醬散具有良好的抗炎療效，臨床被廣泛用于腸道慢性炎癥以及其他炎癥相關(guān)疾病的治療[6-9]。炎癥不僅能夠促進(jìn)T2DM的發(fā)生發(fā)展，而且和T2DM的并發(fā)癥密切相關(guān)[10-11]，因此推測薏苡附子敗醬散可能通過調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌治療T2DM。本研究以腸道菌群研究為基礎(chǔ)，結(jié)合糖脂代謝紊亂的炎癥機(jī)制，探討經(jīng)方薏苡附子敗醬散改善糖脂代謝的作用和機(jī)制，也為中醫(yī)藥臨床療效的研究提供新的思路和途徑。

材料和方法

1 動(dòng)物飼養(yǎng)以及模型構(gòu)建 購買80只雄性SPF級C57BL/6J小鼠，體重在18～22 g之間。在開展實(shí)驗(yàn)之前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周：每5只小鼠養(yǎng)在一個(gè)聚丙烯籠子里面，溫度為(22±2) ℃，濕度為(55±5) %，12 h的光和 12 h的黑暗交替。1周之后改喂養(yǎng)高脂飼料，喂養(yǎng)4周后均禁食12 h，然后在小鼠左下腹腔注射鏈脲佐菌素(130 mg/kg)檸檬酸-檸檬酸鈉注射溶液，在注射后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，第5日禁食6 h，小鼠尾靜脈取血20 μl，測空腹血糖(Fasting blood sugar，F(xiàn)BG)。如果FBG≥11.1 mmol/L則認(rèn)為2型糖尿病小鼠模型構(gòu)建成功。

2 治療和取樣 將2型糖尿病模型構(gòu)建成功小鼠隨機(jī)分為3組，分別為高糖高脂飲食+薏苡附子敗醬散煎液組(中藥組，n=20)，高糖高脂飲食+辛伐他汀組(他汀組，n=20)；高糖高脂飲食+生理鹽水組(對照組，n=20)。中藥組給予中藥原液0.6 g/kg的劑量灌胃給藥，他汀組給予20 mg/(kg·d)的辛伐他汀灌胃給藥，對照組給予等體積的生理鹽水灌胃。治療前眼球取血并收集小鼠糞便，分別檢測血糖、血脂、炎癥因子及腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌。自藥物干預(yù)后第28天每只小鼠眼球取血，頸椎脫臼處死后解剖小鼠，采集盲腸內(nèi)容物，分別檢測血糖、血脂、炎癥因子及腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌。小鼠摘眼球取的全血分別靜置2 h后，3500 r/min離心 15 min，吸取澄清的血清。所有小鼠血清及盲腸內(nèi)容物放在-80 ℃冰箱中保存，備用。

薏苡附子敗醬煎液：薏苡仁36 g，敗醬草15 g，熟附子6 g。將藥物浸泡30 min，按照常規(guī)中草藥煎煮方法，煎煮提取2次，過濾后合并提取液，濃縮為生藥濃度為0.6 g/ml的中藥原液，4 ℃保存。

3 生化指標(biāo)和炎癥因子檢測 血清FPG采用血糖儀測定(羅氏血糖儀，德國Roche公司)；甘油三脂(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)以及脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)采用全自動(dòng)生化分析儀(羅氏COBAS INTEGRA800型)進(jìn)行檢測；白介素6(Interleukin 6，IL-6)采用ELISA試劑盒檢測(試劑盒購自美國ebioscience公司)，操作按照操作說明書進(jìn)行。

4 腸道菌群檢測(實(shí)時(shí)熒光定量PCR) 糞便標(biāo)本按細(xì)菌DNA提取試劑盒(批號(hào)：E.Z.N.A. Stool DNAKit，美國Omega 公司)說明書步驟進(jìn)行糞便處理和提取糞便DNA。引物委托上海生工合成，雙歧桿菌上游引物為5’-GCGTGCTTAACACATGCAAGTC-3’，下游引物為5’-CACCCGTTTCCAGGAGCTATT-3’；乳酸桿菌上游引物為5’-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3’，下游引物為5’-CACCGCTACACATGGAG-3’。雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的檢測方法按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行[12]。簡而言之，首先構(gòu)建雙歧桿菌和乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，使其形成拷貝數(shù)為1012～102拷貝/ml，將以上質(zhì)粒作為陽性模板進(jìn)行qPCR檢測。其次采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司，型號(hào)：7500)檢測糞便標(biāo)本中雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量。反應(yīng)體系如下：DNA，5.0 μl；上游引物，0.5 μl；下游引物，0.5 μl；2×SYBR Green qPCR SuperMix，10 μl；dd H2O，4.0 μl，總體積，20 μl。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 循環(huán)；每個(gè)樣重復(fù)3次；將每份待測標(biāo)本所對應(yīng)的qPCR結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較計(jì)算。菌數(shù)量采用對數(shù)值表示(lgN/g濕便)。

結(jié) 果

1 薏苡附子敗醬散對糖脂代謝的影響 糖尿病模型構(gòu)建后采用薏苡附子敗醬散治療28 d，眼球取血，檢測血清中FPG、TG、TC、HDL和LDL水平，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明中藥組和他汀組治療前和治療后相比FPG、TG、TC和LDL水平都存在顯著差異(P<0.05)，治療后的FPG、TG、TC和LDL的表達(dá)明顯下降，但是HDL水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)；該結(jié)果還表明和對照組治療后相比，他汀組治療后和中藥組治療后FPG、TG、TC和LDL水平明顯下降(P<0.05)，但是HDL水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)；他汀組治療后TG、TC和LDL下降趨勢比中藥組治療后更為顯著，F(xiàn)PG和HDL水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。

表1 治療組和對照組中糖脂代謝指標(biāo)比較

注：治療后和治療前相比，*P<0.05；中藥組和他汀組治療后同對照組治療后相比，#P<0.05；表示中藥組和他汀組治療后相比，&P<0.05

2 薏苡附子敗醬散對炎癥因子和腸道菌群的影響 糖尿病模型構(gòu)建后采用薏苡附子敗醬散治療28 d，眼球取血檢測血清中LPS和IL-6水平，同時(shí)采用qPCR檢測糞便中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，結(jié)果如表2所示。該結(jié)果表明中藥組和他汀組治療前和治療后相比LPS、IL-6、乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量都存在顯著差異(P<0.05)，治療后LPS和IL-6水平顯著下降，而乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加；該結(jié)果還表明和對照組治療后相比，他汀組治療后和中藥組治療后LPS和IL-6水平顯著下降，而乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)；和他汀組相比，中藥組治療后LPS和IL-6的下降更為顯著(P<0.05)；乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量的增加更加顯著(P<0.05)。

表2 治療組和對照組中炎癥因子和腸道菌群的比較

注：治療后和治療前相比，*P<0.05；中藥組和他汀組治療后同對照組治療后相比，#P<0.05；表示中藥組和他汀組治療后相比，&P<0.05

討 論

炎癥和T2DM的發(fā)生發(fā)展以及并發(fā)癥密切相關(guān)[10]。在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中LPS和炎癥因子的表達(dá)顯著增加，引發(fā)胰島素抵抗，最終導(dǎo)致糖尿病以及并發(fā)癥(例如大量白蛋白尿)的出現(xiàn)[11]，在某些藥物治療糖尿病的過程中CRP、IL-6和TNF-α的水平的明顯降低，間接反映藥物的治療效果[3]。本研究結(jié)果表明薏苡附子敗醬散在治療糖尿病的過程中能夠顯著降低LPS和IL-6的水平，發(fā)揮抗炎癥作用。

腸道菌群和糖尿病有著密切關(guān)系。腸道菌群可以改善葡萄糖耐受，恢復(fù)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌，降低內(nèi)毒素血癥和炎癥因子水平，并最終改善糖尿病患者的代謝紊亂。我們通過前期的臨床研究表明，黃連素治療可以增加T2DM患者腸道雙歧桿菌的數(shù)量并降低患者體內(nèi)的炎癥因子水平[3]，而且雙歧桿菌的數(shù)量和炎癥因子水平具有負(fù)相關(guān)性。本研究結(jié)果表明薏苡附子敗醬散在治療糖尿病的過程中能夠增加乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道菌群的分布。

他汀類藥物是臨床上最常用且療效確切的一種降血脂藥物。本研究表明辛伐他汀能夠顯著降低糖尿病小鼠血清中FPG、TG、TC、LDL水平。和薏苡附子敗醬散組相比，辛伐他汀組治療后糖尿病小鼠血清中FPG、TG、TC、LDL水平顯著降低，但LPS和IL-6的水平顯著高于薏苡附子敗醬散組，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著低于薏苡附子敗醬散組。以上結(jié)果說明薏苡附子敗醬散可能是通過降低炎癥因子表達(dá)、調(diào)節(jié)腸道菌群分布而改善糖脂代謝。

糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇。《素問·奇病論》：“有病口甘者……名曰脾癉，此肥美之所發(fā)也，其人必?cái)?shù)食甘美而多肥，甘者令人中滿，肥者令人內(nèi)熱，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴。”消渴“內(nèi)熱”這一基本病機(jī)，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)糖尿病炎癥狀態(tài)的認(rèn)識(shí)基本一致。薏苡附子敗醬散出自《金匱要略》：“腸癰之為病，其身甲錯(cuò)，腹皮急，按之濡，如腫狀，腹無積聚，身無熱，脈數(shù)，此為腸內(nèi)有癰膿，薏苡附子敗醬散主之”。薏苡仁十二分，敗醬草五分，熟附子二分。方中重用薏苡仁，一可清熱利濕除濕熱之標(biāo)，二可健脾益胃除生濕之源，三可排膿消癰治療局部炎癥，為君藥。敗醬草清熱解毒、消癰排膿，活血祛瘀止痛。佐以少量附子，假其辛熱以行郁滯之氣。薏苡附子敗醬散臨床上常被用于治療痢疾、腹腔膿腫、細(xì)菌性肝膿腫、克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性盆腔炎等炎癥性疾病，療效確切。

總之，本研究證實(shí)薏苡附子敗醬散能夠增加乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，降低炎癥因子LPS和IL-6的水平，改善糖尿病小鼠的糖脂代謝，從腸道菌群和炎癥方面探討薏苡附子敗醬散對糖尿病小鼠模型的影響，為臨床應(yīng)用薏苡附子敗醬散治療糖尿病提供新的理論依據(jù)。

[1] Naqshbandi M，Harris SB，Esler JG，etal. Global complication rates of type 2 diabetes in indigenous peoples：A comprehensive review [J]. Diabetes Res ClinPract，2008,82(1)：1-17.

[2] Tai N，Wong FS，Wen L. The role of gut microbiota in the development of type 1，type 2 diabetes mellitus and obesity [J]. Rev EndocrMetabDisord，2015,16(1)：55-65.

[3] 陳玲玲，陸文松，廖水玉，等. 黃連素對2型糖尿病患者血清炎癥因子水平及腸道雙歧桿菌的影響 [J]. 中醫(yī)雜志，2016,57(23)：2028-2031.

[4] 李吉武，唐愛華，趙 偉，等. 溫陽益氣活血方對肥胖2型糖尿病患者腸道菌群變化及脂質(zhì)代謝的影響 [J]. 中醫(yī)雜志，2015,56(5)：409-413.

[5] Wang Y，Luo X，Mao X，etal. Gut microbiome analysis of type 2 diabetic patients from the chinese minority ethnic groups the uygurs and kazaks [J]. PLoS One，2017,12(3):256-258.

[6] 孔令青. 大柴胡湯合薏苡附子敗醬散改善ⅲ型前列腺炎疼痛癥狀 [J]. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2016,22(9)：1270-1272.

[7] 李 洋，王政醫(yī)，梁海彬. 薏苡附子敗醬散聯(lián)合西藥治療急性放射性直腸炎36例 [J]. 中醫(yī)研究，2015,28(6)：35-36.

[8] 王碧芬，鄭小平，陸海英，等. 薏苡附子敗醬散加味湯對慢性盆腔炎患者血液流變學(xué)及血清C-反應(yīng)蛋白的影響 [J]. 浙江中醫(yī)雜志，2015,50(11)：792-793.

[9] 張雙喜，史仁杰. 薏苡附子敗醬散對TNBS結(jié)腸炎模型大鼠Treg/Th17的影響 [J]. 世界華人消化雜志，2014,22(11)：1542-1546.

[10] Roman-Pintos LM，Villegas-Rivera G，Rodriguez-Carrizalez AD，etal. Diabetic polyneuropathy in type 2 diabetes mellitus：Inflammation，oxidative stress，and mitochondrial function [J]. J Diabetes Res，2016：3425617.

[11] Fallucca F，Porrata C，F(xiàn)allucca S，etal. Influence of diet on gut microbiota，inflammation and type 2 diabetes mellitus. First experience with macrobiotic ma-pi 2 diet [J]. Diabetes Metab Res Rev，2014,1:48-54.