軟皮熱敷散中芳香水的提取工藝研究*

任 慧，李佰成，張 紅

陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

硬皮病(Scleroderma，Scl)是一種以皮膚、血管和內(nèi)臟器官的纖維化，體內(nèi)產(chǎn)生大量破壞各種細(xì)胞成分的自身抗體為特征的結(jié)締組織病，發(fā)病有3個(gè)基本過(guò)程，即纖維化、炎癥和血管功能障礙[1-2]。中醫(yī)沒(méi)有硬皮病這一名稱(chēng)，也沒(méi)有確切的中醫(yī)病名與之相對(duì)應(yīng)。根據(jù)皮膚增厚變硬、手指腫脹僵直、肢體關(guān)節(jié)疼痛等臨床表現(xiàn)，將硬皮病歸于“痹證”范疇[3]。其病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及血管異常、免疫異常及膠原異常等，近年來(lái)研究表明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)等多種細(xì)胞因子可能在硬皮病纖維化的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，目前該疾病尚無(wú)特效治療方法[4]。扶正祛邪是硬皮病的根本治則，扶正以益氣養(yǎng)血、溫補(bǔ)脾腎為主，祛邪以祛風(fēng)散寒除濕、活血化痰通絡(luò)為主，亦可歸納為“補(bǔ)”、“通”二字[3]。軟皮熱敷散是陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科用于治療硬皮病的經(jīng)驗(yàn)處方，療效卓著。該方由艾葉、桂枝、陳皮、山豆根、威靈仙、劉寄奴、紅花等中藥組成，具有活血通絡(luò)、散寒祛濕之功，用于皮痹、凍瘡、雷諾氏病、蛇串瘡后遺神經(jīng)痛等病。由于該藥使用前需用布包上籠屜加熱30min后熱敷，操作繁復(fù)，為了方便推廣使用，考慮將其改為軟膏劑[5-6]。因而，需要對(duì)該處方藥材的提取工藝及制劑的制備工藝進(jìn)行研究。一般對(duì)藥材采取水提、醇提工藝研究較多，而對(duì)處方中的藥材揮發(fā)性成分提取率很低，往往藥材中揮發(fā)性成分是處方中一大類(lèi)具有生物活性的物質(zhì)。該處方中艾葉的主要活性物質(zhì)為揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、三萜類(lèi)、桉葉烷類(lèi)、多糖類(lèi)及微量元素等成分，其揮發(fā)油中含量較高的成分為桉樹(shù)腦、石竹烯、石竹烯氧化物、3-金鐘柏酮、龍腦、4-香芹孟烯醇、刺柏腦、反-p-2,8-二烯薄荷醇等[7]。桂枝的化學(xué)物質(zhì)主要有揮發(fā)油類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、多糖類(lèi)、香豆素類(lèi)及鞣質(zhì)類(lèi)成分，其揮發(fā)油中主要含有桂皮醛、桂皮醇、甲氧基桂皮醛、苯甲醛、3-羥基苯甲醛、2-丙烯-1-醇-3-苯基乙酸酯、茨烯、桉葉素-對(duì)傘花烴、萜烯-4-醇、α-胡椒烯、β-欖香烯、白菖蒲烯等[8]。陳皮中主要活性物質(zhì)為揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、有機(jī)胺類(lèi)及微量元素等成分，其揮發(fā)油約占2%～4%，主要含有D-檸檬烯、γ-松油烯、β-月桂烯、α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇、檸檬醛、α-萜品醇等[9]。可見(jiàn)，處方中艾葉、桂枝、陳皮等為富含揮發(fā)性成分的藥材，然而揮發(fā)性成分的含量一般較低，難以提取到揮發(fā)油，因而實(shí)驗(yàn)室考慮采用水蒸氣蒸餾法提取芳香水[10-11]。為了優(yōu)化軟皮熱敷散中芳香水的提取工藝，借助芳香水在紫外波長(zhǎng)下有吸收峰的特點(diǎn)，采用紫外分光光度法及薄層層析法對(duì)芳香水的提取工藝進(jìn)行研究；剩余殘?jiān)鼊t以橙皮苷的含量及干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選水提條件[12]。

儀器與試藥

1 儀 器 日本島津生產(chǎn)的2010A-UV型高效液相色譜儀，日本日立高新技術(shù)公司生產(chǎn)的U-2910型紫外分光光度計(jì)，西安武本生物科技有限公司的Woburn LP-C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)，揮發(fā)油提取器，北京市永光明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)的101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司的HSY-2MB電熱恒溫水浴鍋，慈溪紅鉆衡器設(shè)備有限公司生產(chǎn)的HZ2001A稱(chēng)量天平，北京賽多利斯天平有限公司生產(chǎn)的BT25S型和BS210S型電子分析天平。

2 試 藥 處方中所用艾葉、桂枝、陳皮等藥材均由陜西省中醫(yī)醫(yī)院提供；橙皮苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110721-200613)；色譜純甲醇(美國(guó)FISHER公司)，純化水，石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、醋酸、濃硫酸、二硝基苯肼均為分析純，硅膠G(青島海洋化工)。

方法與結(jié)果

1 芳香水的提取工藝

1.1 芳香水的提取

1.1.1 吸水率的測(cè)定：按照處方比例稱(chēng)取艾葉、桂枝、陳皮等藥材共計(jì)52.5 g，加水400 ml，浸泡過(guò)夜[13]，過(guò)濾，計(jì)算藥材吸水率為202 %。

1.1.2 揮發(fā)油的提?。喊凑仗幏奖壤Q(chēng)取艾葉、桂枝、陳皮等藥材共計(jì)52.5 g，加入10倍量的水，浸泡45 min[14]，且補(bǔ)足吸水率，水蒸氣蒸餾，并適當(dāng)控制蒸餾速度，蒸餾提取6 h，得到揮發(fā)油量約0.15 ml，提取率較低。

1.1.3 芳香水提?。喊凑仗幏奖壤Q(chēng)取艾葉、桂枝、陳皮等藥材共計(jì)52.5 g，加20倍量的水，浸泡45 min，水蒸氣蒸餾，適當(dāng)控制蒸餾速度，分別于0.5、1、2、3、4、5、6 h收集芳香水，共7份，備用。

1.2 薄層層析：用毛細(xì)管分別吸取0.5、1、2、3、4、5、6 h處收集的芳香水各5 μl，并分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(17：3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，然后用冷風(fēng)吹干，噴以二硝基苯肼試液顯色，日光下觀察，可以看見(jiàn)清晰的斑點(diǎn)，直觀分析揮發(fā)油的提取程度(圖1)[15]。

由圖1可看出，水蒸氣蒸餾法提取4 h以后，薄層斑點(diǎn)已不是很明顯，說(shuō)明揮發(fā)性成分已基本提盡，故初步確定芳香水的提取時(shí)間為4 h[10]。

1.3 吸光度的測(cè)定

1.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定:精密吸取收集的第一份芳香水2 ml，置于10 ml容量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度定容，借助紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在200 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，根據(jù)掃描結(jié)果顯示的芳香水最大吸收波長(zhǎng)，選定在351 nm處檢測(cè)。

1.3.2 吸光度的測(cè)定:精密吸取各時(shí)間段內(nèi)收集的軟皮熱敷散芳香水2 ml，置10 ml容量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度定容后，并于351 nm處測(cè)定吸光度值，結(jié)果見(jiàn)表1(圖2)。

表1 芳香水收集表

注：∑Ai=收集量×吸光度A,百分比%=∑Ai/∑A總(∑A總=∑A1+∑A2+……+∑A7)

圖1 芳香水的薄層層折圖2 芳香水收集

由表1和圖2可以看出軟皮熱敷散芳香水收集時(shí)間達(dá)4h時(shí)，已累計(jì)得到95.30%，表明軟皮熱敷散中揮發(fā)性成分已經(jīng)基本提取完全，因此確定軟皮熱敷散芳香水的提取時(shí)間以4 h為宜[10]。

由表1可知，軟皮熱敷散采用水蒸氣蒸餾4 h內(nèi)收集到508 ml芳香水，約為提取藥材量的9.7倍，可以明顯看出軟皮熱敷散芳香水收集量過(guò)多，因此需要進(jìn)行二次蒸餾[16]，采用上述方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2(圖3)。由結(jié)果可判斷二次蒸餾以3 h為宜。

表2 芳香水二次蒸餾收集表

2 殘?jiān)奶崛」に?稱(chēng)取艾葉、桂枝、陳皮等藥材，共三份，分別加20倍量的水，收集4 h內(nèi)的芳香水，過(guò)濾，保留濾液，剩余殘?jiān)?0倍量的水回流提取，分別提取1、1.5、2h，合并濾液，備用，考察殘?jiān)淖罴阉釙r(shí)間。

2.1 橙皮苷的測(cè)定

2.1.1 色譜條件[12，17]為流動(dòng)相：甲醇-醋酸-水(35：4：61)；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。

2.1.2 橙皮苷對(duì)照品溶液的制備：取橙皮苷對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇定容，制成200 μg/ml的橙皮苷溶液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備：精密吸取水提液1 ml，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備：按照處方比例稱(chēng)取軟皮熱敷散藥材(去除陳皮)[18]，并按照軟皮熱敷散提取工藝制備提取液，再精密吸取本品溶液1 ml，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

2.1.5 供試品溶液的測(cè)定：供試品色譜圖與橙皮苷對(duì)照品色譜圖在相同時(shí)間處有色譜峰，陰性對(duì)照溶液色譜圖與橙皮苷對(duì)照品色譜圖相比在相同時(shí)間處無(wú)吸收峰，表明軟皮熱敷散中其它藥材對(duì)橙皮苷的測(cè)定無(wú)干擾[19]。在該條件下測(cè)定不同提取時(shí)間的水提液中橙皮苷含量分別為278.95、273.18、278.67 mg。

2.2 干膏得率的測(cè)定：用移液管精密量取提取液50 ml，分別轉(zhuǎn)移至已經(jīng)恒重的蒸發(fā)皿中，放置在水浴鍋上蒸干，再將其置于105℃烘箱中干燥3h[13]，取出后放置在干燥器中冷卻30min至室溫，迅速稱(chēng)定重量，計(jì)算干膏得率分別為20.69 %、20.82 %、21.00 %。

綜上所述，采用不同時(shí)間得到的軟皮熱敷散提取液中橙皮苷的含量和干膏得率差異不是很大，從節(jié)約成本和實(shí)際需要等因素綜合考慮，剩余殘?jiān)捎?0倍量的水加熱回流提取1h為宜。

3 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱(chēng)取艾葉、桂枝、陳皮等藥材，共三份，分別加20倍量的水，浸泡45min，收集芳香水4h，過(guò)濾，殘?jiān)?0倍量水提取1h，合并濾液。經(jīng)薄層層析(圖4)可見(jiàn)提取4h內(nèi)芳香水斑點(diǎn)清晰，且殘?jiān)某绕ぼ仗崛÷屎透筛嗟寐手貜?fù)性好，見(jiàn)表3。

圖3 芳香水二次蒸餾的薄層層折 圖4 芳香水的薄層層折

編 號(hào)藥材量(g)橙皮苷含量(mg)干膏得率(%)1號(hào)52．5279．5420．872號(hào)52．5264．9520．823號(hào)52．5275．1821．41平均值52．5273．2321．03RSD(%)2．741．56

討 論

軟皮熱敷散是陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科用于治療硬皮病的經(jīng)驗(yàn)處方，療效卓著。處方中艾葉味辛、苦，性溫，具有溫經(jīng)止血，散寒止痛，除濕殺蟲(chóng)之功；桂枝味辛、甘，性溫，具有散寒解表、溫通經(jīng)脈、通陽(yáng)化氣之功；陳皮味苦、辛，性溫，具有理氣健脾、燥濕化痰之功效；山豆根味苦，性寒，能清熱解毒；威靈仙味辛、咸，性溫，能祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)；劉寄奴味苦，性寒，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血、清熱利濕之功效；紅花味辛，性溫，能活血通經(jīng)，祛瘀止痛。由于該藥使用操作繁復(fù)，不便于推廣使用，考慮將其改為軟膏劑。中藥揮發(fā)油是一大類(lèi)重要的有效成分，具有較強(qiáng)的藥理作用，其透皮吸收促進(jìn)作用強(qiáng)[20]。因此，對(duì)軟皮熱敷散中富含揮發(fā)性成分的藥材的提取工藝進(jìn)行研究是非常有必要的。采用水蒸氣蒸餾的方法提取軟皮熱敷散中的揮發(fā)油，觀察到蒸餾6h得到揮發(fā)油量約0.15 ml，得率較低，其原因可能為軟皮熱敷散藥材中揮發(fā)性物質(zhì)總量較少，在蒸餾過(guò)程易被乳化或溶解[21]。同時(shí)觀察到軟皮熱敷散提取到的芳香水氣味濃郁，但是芳香水中的揮發(fā)性成分與水很難分離，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嘗試加入食鹽、冷藏的辦法也沒(méi)有分層，因此考慮改為以芳香水加入制劑。水蒸氣蒸餾法提取芳香水，能較好地保留揮發(fā)性有效組分，工藝操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉[21]。另外，該方法不使用有機(jī)溶劑，省去了除去有害雜質(zhì)的過(guò)程，綠色環(huán)保。

本研究確定的水蒸氣蒸餾法提取軟皮熱敷散富含揮發(fā)性物質(zhì)藥材的最佳提取條件為加20倍量水，浸泡45 min，蒸餾提取4 h，合并收集芳香水；提取液過(guò)濾，殘?jiān)?0倍量水，提取1 h，合并提取液。該方法科學(xué)、合理、穩(wěn)定、可行，可為生產(chǎn)開(kāi)發(fā)提供參考。

[1] 巫婷婷，周京國(guó). 硬皮病動(dòng)物模型及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(2)：102-105.

[2] Abraham D J,Varga J. Scleroderma：from cell and molecular mechanisms to disease models[J]. Trends Immunol，2005，26(11)：587-595.

[3] 梁 輝. 中醫(yī)治療硬皮病研究進(jìn)展[J]. 社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2012，10(21)：19-20.

[4] 趙 云，李建勤，黃長(zhǎng)征. 細(xì)胞因子與硬皮病研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2017，16(2)：171-173.

[5] 林俊華，蔡 翔，蘇明武，等. 防茄軟膏的制備工藝研究[J]. 首都醫(yī)藥，2014，11(14)：86-88.

[6] 夏 晨，談 戈. 淺談我院中藥軟膏劑的制備工藝與質(zhì)量控制[J]. 北方藥學(xué)，2016，13(3)：112-113.

[7] 王惠君，王文泉，盧 城，等. 艾葉研究進(jìn)展概述[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(8)：15-19，44.

[8] 許 源，宿樹(shù)蘭，王團(tuán)結(jié)，等. 桂枝的化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中藥材，2013，36(4)：674-678.

[9] 李曉芳，張健康，王慧鸞，等. 陳皮的研究進(jìn)展[J]. 江西中醫(yī)藥，2014，45(37)：76-78.

[10] 張海先，李 瓊，曾 銳. 清目口服液中菊花芳香水提取工藝研究[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，39(3)：330-332.

[11] 蒲志強(qiáng)，周 立，盛 蓉，等. 鼻炎通竅噴霧劑的提取工藝研究[J]. 中成藥，2011，33(9)：1604-1607.

[12] 董 村，趙 宇. 高效液相色譜法測(cè)定桑椹枸杞酒中橙皮苷的含量[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2016，31(7)：2800-2802.

[13] 劉軍鋒，華 瑛，王紅波，等. 痰飲膏劑型改進(jìn)的工藝研究[J]. 陜西中醫(yī)，2014，35(7)：914-916.

[14] 趙海峰，鄭 潔，張 萌，等. 芳香性中藥煎藥方法研究[J]. 陜西中醫(yī)，2013，34(1)：84-86.

[15] 何 姣，張雅惠，孫文基. 肉桂、桂枝薄層鑒別方法之改進(jìn)初探[J]. 中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2008，9(1)：34-35.

[16] 王志超. 雙花噴霧劑制備工藝研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003，9(4)：21，25.

[17] 項(xiàng) 菲，肖 燕. 高效液相色譜法測(cè)定小兒止咳糖漿橙皮苷的含量[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2008，17(7)：31-32.

[18] 孫麗娜，劉小虹，劉建博，等. 復(fù)方五指毛桃顆粒的提取工藝研究[J]. 中國(guó)藥房，2017，28(28)：3976-3979.

[19] 徐文杰，周 蓉，王洛臨，等. 活血化瘀顆粒提取工藝優(yōu)選[J]. 中藥材，2014，37(9)：1667-1672.

[20] 陳 軍，劉 培，蔣秋冬，等. 中藥揮發(fā)油作為透皮吸收促進(jìn)劑的現(xiàn)狀與展望[J]. 中草藥，2014，45(24)：3651-3655.

[21] 劉 智，郭艷波. 金銀花芳香水提取研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥，2012，25(2)：241-242.