基于高通量測序分析健康人咀嚼檳榔前后口腔菌群多樣性

熊雄，易書瀚，趙紫薇，成煥，吳忠坤，郭亦晨，李珂,2,3，王遠亮,2,3

1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.海南聯(lián)合檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心，海南 海口 570100

檳榔作為現(xiàn)代社會一種快速消費品正逐漸被大眾所接受，并成增長趨勢。首先，檳榔中含有檳榔堿、檳榔次堿等重要的生物堿，這些生物堿對人體口腔均有不同程度的毒性作用，長時間咀嚼檳榔還能導致口腔黏膜下纖維性變(OSF)及口腔鱗狀細胞癌(OSCC)[1-3]。因此咀嚼檳榔大多數(shù)都是對口腔具有毒性作用。事實上，一個健康人口腔中含有億萬多的微生物，這其中絕大多數(shù)都是口腔菌群的正常微生物群落，當口腔過量咀嚼檳榔時，口腔黏膜組織會被破壞，這可能是咀嚼檳榔時口腔過度用力，導致檳榔殘渣隨同牙齒在口腔中來回摩擦，進而刺激口腔黏膜，造成口腔機械性物理損傷。研究咀嚼檳榔對口腔造成的不可逆?zhèn)κ强谇晃⑸锒鄻有苑治龅闹匾獌?nèi)容，這對防治口腔疾病有著重要作用。隨著科學的不斷進步，利用分子生物學研究口腔微生物多樣性已然成為當下趨勢，相比傳統(tǒng)的16S rDNA方法，高通量測序技術(shù)具有高準確性，高通量，高靈敏度和低運行成本等突出優(yōu)勢。本研究利用高通量測序方法對健康人咀嚼檳榔前后的唾液進行對比分析來探討口腔微生物菌群結(jié)構(gòu)分布及微生物群落多樣性，以期為食用檳榔與口腔微生態(tài)相關(guān)性研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1檳榔 選自湖南某檳榔制造企業(yè)市售食用成品檳榔。

1.1.2健康人選取標準 從湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院選取8個健康成年人，年齡21～25周歲，被選者3個月內(nèi)無注射或服用抗生素，無吸煙，無全身系統(tǒng)性疾病，無口腔潰瘍，無進行口腔局部創(chuàng)傷手術(shù)，8人在此之前均無咀嚼過檳榔。

1.1.3健康人咀嚼檳榔前后唾液樣本收集 采集咀嚼檳榔前的唾液樣品，8名入選者用0.85%無菌生理鹽水輕輕漱口1～2 min，采集自然排出的唾液2 mL，標記為Qa、Qb、Qc、Qd、Qe、Qf、Qg、Qh，記為Q組。同樣，采集咀嚼檳榔后的唾液樣品，入選者輕輕漱口1～2 min，然后咀嚼半顆檳榔(7～10 g)，直至無甜味，檳榔殘渣呈破裂纖維狀，采集自然排出的唾液2 mL，對同一個體咀嚼5 min后、吐出檳榔后30 min采集唾液，分別標記為Ha5、Ha30、Hb5、Hb30、Hc5、Hc30、Hd5、Hd30、He5、He30、Hf5、Hf30、Hg5、Hg30、 Hh5、Hh30，記為H5組、H30組。所有采集的唾液均在-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1基因組總DNA提取及PCR擴增 各樣品DNA的提取采用GV-Bacterial Genomic DNA Extraction Kit試劑盒提取，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性、純度、片段大小和濃度。通過參考Walter等文獻，采用口腔微生物16S rDNA通用引物HAD-1/HAD-2擴增V4區(qū)。50 μL PCR體系擴增程序為：95℃ 5 min預變性；98℃ 10 s，46℃ 15 s，72℃ 1 min，40個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR結(jié)束后，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，對目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。提取質(zhì)量合格的DNA樣品，將樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進行口腔微生物16S rDNA V4區(qū)HiSeq2500 PE250測序平臺的高通量測序。

1.2.2數(shù)據(jù)分析 利用Uparse軟件[5]對所有樣品的全部Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，同時會選取OTUs的代表性序列，對OTUs代表序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA[6]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[7]進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1.0)，分別在界、門、綱、目、科、屬、種統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE[8]軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理。另外，使用Qiime軟件計算物種數(shù)(Observed-species)、Chao1指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener index)、辛普森指數(shù)(Simpson′ index)、ACE指數(shù)、深度測序指數(shù)(Good′s coverage)。

2 結(jié) 果

2.1基因組總DNA提取及PCR擴增 全部樣品基因組經(jīng)過DNA提取后，所有樣品均在200 bp左右，條帶均清晰可見，滿足后續(xù)測序需要，見圖1。

注：M：DNA標準分子量，1：Qa，2：Ha5，3：Ha30，4：Qb，5：Hb5，6：Hb30，7：Qc，8：Hc5，9：Hc30，10：Qd，11：Hd5，12：Hd30，13：Qe，14：He5，15：He30，16：Qf，17：Hf5，18：Hf30，19：Qg，20：Hg5，21：Hg30，22：Qh，23：Hh5，24：Hh30。

圖1PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2基因組菌群測序結(jié)果分析 所有樣品的基因組DNA經(jīng)PCR擴增16S rDNA V4區(qū)后進行高通量測序，經(jīng)統(tǒng)計分析獲得序列的alpha多樣性。所有組別樣品的測序覆蓋率均在97%以上，表明樣品中序列未被測到的概率低，見表1。

細菌群落豐富度用Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)表示，其值越高表明群落物種的豐富度越高；細菌群落多樣性程度用香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener index)和辛普森指數(shù)(Simpson′ index)表示，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。在所有樣品組別中，相對于咀嚼檳榔前的口腔微生物多樣性，咀嚼檳榔5 min及30 min后，被發(fā)現(xiàn)的物種逐漸增多，ACE和Chao1指數(shù)降低，表明樣品中菌群相對豐度降低。而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)高，表明菌群的多樣性高。

表1 咀嚼檳榔前、咀嚼5 min后和咀嚼30 min后口腔微生物菌群的alpha多樣性比較

注：Q組：咀嚼檳榔前，H5組：咀嚼5 min后，H30組：吐出檳榔，咀嚼30 min后。

2.3細菌基因組菌群多樣性分析

2.3.1基于門水平的細菌菌群結(jié)構(gòu)分析 用Mothur方法與SILVA 的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1.0)，獲得分類學信息中門水平的群落組成，見表2。在咀嚼檳榔前、咀嚼5 min后和咀嚼30 min后，所有樣品中的總細菌菌群相對豐度大于1%的菌門主要包含變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)，見圖2。咀嚼檳榔前的平均相對豐度分別為31.0%、32.9%、17.2%、5.4%、3.7%、1.9%、2.2%，咀嚼5 min后分別為31.2%、32.2%、15.2%、4.6%、5.3%、2.2%、2.5%，咀嚼30 min后分別為34.7%、29.0%、14.0%、5.2%、5.2%、2.4%、2.5%。不同個體在門水平上的統(tǒng)計分析結(jié)果還包括少量的酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、螺旋體門(Spirochaetes)、放線菌門(Actinobacteria)等。

注：Q組：咀嚼檳榔前，H5組：咀嚼5 min后，H30組：吐出檳榔，咀嚼30 min后。

圖2 咀嚼檳榔前、咀嚼5 min后和咀嚼30 min后菌群在門水平上的相對豐度分布圖

注：Q組：咀嚼檳榔前，H5組：咀嚼5 min后，H30組：吐出檳榔，咀嚼30 min后。

2.3.2基于屬水平的細菌菌群結(jié)構(gòu)分析 基于宏基因組DNA測序的結(jié)果顯示，在Q組、H5組和H30組中，相對豐度較大菌群在屬水平上的分布見圖3。鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、奈瑟菌屬(Neisseria)相對豐度均大于5%，為主要菌群。而口腔微生物的30種核心菌屬在3個樣品組均有分布，分別占總量的62.93%、57.78%、58.77%。

在咀嚼檳榔前，口腔內(nèi)菌群相對豐度大于1%菌屬的有鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、奈瑟菌屬(Neisseria)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、普雷沃菌屬(Prevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)、羅思氏菌屬(Rothia)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、兼性雙球菌屬(Gemella)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)，占總量的52.98%，其中鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、奈瑟菌屬(Neisseria)的相對豐度最大。在咀嚼5 min后，上述這14種相對豐度較大的菌屬中，擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)和兼性雙球菌屬(Gemella)相對豐度均小于1%，其余菌屬均大于1%。在咀嚼30 min后，兼性雙球菌屬(Gemella)均相對豐度小于1%，其余菌屬均大于1%。而乳球菌屬(Lactococcus)、加德納菌屬(Gardnerella)在咀嚼檳榔前未被檢出，見表3。

在咀嚼5 min后，鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、普雷沃菌屬(Prevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)、普雷沃菌_6屬(Prevotella_6)、兼性雙球菌屬(Gemella)的相對豐度均降低，而奈瑟菌屬(Neisseria)、羅思菌屬(Rothia)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)的相對豐度均增大。在咀嚼30 min后，纖毛菌屬(Leptotrichia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)、羅思菌屬(Rothia)的相對豐度均增大。

注：Q組：咀嚼檳榔前，H5組：咀嚼5 min后，H30組：吐出檳榔，咀嚼30 min后。

圖3 咀嚼檳榔前、咀嚼5 min后和咀嚼30 min后菌群在屬水平上的相對豐度分布圖

注：Q組：咀嚼檳榔前，H5組：咀嚼5 min后，H30組：吐出檳榔，咀嚼30 min后。

3 討 論

3.1咀嚼檳榔前后口腔微生態(tài)研究 本研究通過高通量測序平臺對8名健康成年人在咀嚼檳榔前、咀嚼5 min后和咀嚼30 min后的唾液進行對比分析，來探討口腔微生物菌群結(jié)構(gòu)分布及微生物群落多樣性。研究結(jié)果表明，在已知檢出的高豐度菌群中，大部分菌群在咀嚼檳榔5 min后較咀嚼前微生物群落多樣性降低，包括鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、普雷沃菌屬(Prevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、兼性雙球菌屬(Gemella)。而在咀嚼5 min后，吐出檳榔，30 min后，少數(shù)菌群如纖毛菌屬(Leptotrichia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)、羅思菌屬(Rothia)微生物群落多樣性增大。特別地，鏈球菌屬(Streptococcus)、韋榮球菌屬(Veillonella)作為主要變化的菌屬在咀嚼檳榔的過程中，對口腔產(chǎn)生一定的作用，可能是口腔齲齒等牙周疾病的直接或間接影響因子，其作用機制還需進一步驗證。

人口腔在咀嚼檳榔5 min后，口腔快速與檳榔進行互相作用，檳榔中的檳榔堿、檳榔次堿等生物堿發(fā)揮一定的毒性作用，表現(xiàn)在明顯的抑菌方面，導致菌群數(shù)量減少[9]。此外，附著在口腔內(nèi)壁上的正常菌群由于口腔咀嚼機械性運動，口腔內(nèi)壁不斷與檳榔進行摩擦，這也可能是導致大部分菌群數(shù)量減少的原因。而當咀嚼5 min后，吐出檳榔，30 min后，口腔中沒有進行任何咀嚼活動及進食，口腔內(nèi)大部分菌群數(shù)量明顯增多，口腔重回內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。乳球菌屬(Lactococcus)和加德納菌屬(Gardnerella)在咀嚼5 min后檢出，這可能是檳榔本身帶入的外源性菌屬。而鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、奈瑟菌屬(Neisseria)成為主要變化的菌屬，作為口腔微生物的重要成員，其自身的存在是口腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)。這些菌群呈高豐度分布，維持著微生物之間及微生物與宿主之間相互作用。

3.2咀嚼檳榔對口腔及口腔菌群關(guān)系的影響 在咀嚼檳榔時，牙齒接受檳榔的不斷往復摩擦，牙床松動，牙齦紅腫，導致牙周炎癥。鏈球菌屬(Streptococcus)和韋榮球菌屬(Veillonella)作為齲齒、牙周炎等口腔疾病的參與者，發(fā)揮了重要的作用。在中國，食用檳榔是經(jīng)過檳榔鮮果加工而產(chǎn)生的一種咀嚼食品，具有高甜度的特點。當短時接觸高甜度食品，口腔中微生物產(chǎn)酸能力增大，正常情況下，口腔唾液具有緩沖作用，產(chǎn)酸耐酸菌群的產(chǎn)酸能力超過唾液緩沖能力后，牙菌斑中對酸性環(huán)境敏感的菌群生長受到抑制，導致產(chǎn)酸耐酸菌成為優(yōu)勢菌種，最終出現(xiàn)齲齒[10-11]。鏈球菌屬(Streptococcus)是齲齒患者口腔中的優(yōu)勢菌，尤其是產(chǎn)酸鏈球菌在齲齒患者口腔中分布更多[12-13]。韋榮球菌屬(Veillonella)作為齲齒活動口腔中的高豐度分布菌屬，其豐度及多樣性也影響口腔健康[14]。韋榮球菌屬(Veillonella)不能直接代謝糖類產(chǎn)酸，但它能利用鏈球菌屬產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物如琥珀酸、丙酮酸、乳酸等作為營養(yǎng)物來源[15]，這也提示鏈球菌屬(Streptococcus)和韋榮球菌屬(Veillonella)作為協(xié)同菌在齲齒等牙周疾病中發(fā)揮了重要作用，但兩者協(xié)同的具體機制還需進一步研究。此外，增大樣本量也是下一步研究開展的關(guān)鍵步驟，由于個體差異性，不同個體的口腔健康情況直接影響研究的進行，因此，排除個體差異性同樣重要。

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