小麥蛋白酶解物-槲皮素復(fù)合納米顆粒的構(gòu)建及表征

韋翠蘭，歐陽(yáng)穎，王夢(mèng)萍，楊曉泉，王金梅

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

槲皮素(Quercetin，Que)是一類(lèi)來(lái)源于豆科植物的黃酮類(lèi)化合物，顯示出廣泛的健康促進(jìn)作用，如抗癌、肝臟保護(hù)、抗糖尿病和抗菌活性等[1]。然而，槲皮素為疏水性物質(zhì)，其較低的水溶性和不穩(wěn)定性嚴(yán)重限制了其在藥物和食品領(lǐng)域中的應(yīng)用[2,3]。研究表明，納米技術(shù)可以成為提高疏水性物質(zhì)的水溶性及其生物利用度的重要工具[4,5]。因此，找尋合適的載體使槲皮素有效的發(fā)揮其生物活性是關(guān)鍵問(wèn)題。

目前，已有多種物質(zhì)成功用于水溶性槲皮素納米顆粒的制備。利用聚D,l-丙交酯(PLA)[6]和殼聚糖-藻酸鹽[7]包封Que，可以改善Que的溶解性，但形成的顆粒均有較大粒徑（分別為130±30 nm和900 nm左右）。蛋白質(zhì)活性基團(tuán)與疏水多酚能發(fā)生非共價(jià)相互作用（如疏水相互作用、氫鍵、靜電相互作用以及π水相堆積等），形成膠體輸送體系，從而達(dá)到對(duì)疏水活性營(yíng)養(yǎng)成分輸送的目的[8,9]。鑒于此，蛋白質(zhì)亦可以用做槲皮素的荷載載體，以期提高其水溶性和生物利用率。Ant?nio等[10]人報(bào)道，牛血清蛋白-槲皮素納米顆粒荷載率不高，約為85%；Patel等[11]也指出，玉米醇溶蛋白-槲皮素納米顆粒由于靜電斥力作用易發(fā)生聚集。小麥蛋白含有大量的疏水性氨基酸，具有天然的兩親特性及自組裝能力，是制備功能性膠體顆粒的優(yōu)良材料[12]。通過(guò)反溶劑沉淀[13]法，能夠與疏水性物質(zhì)（如，白藜蘆醇[14]、槲皮素[11]、α-生育酚[15]和姜黃素[16]）形成穩(wěn)定的復(fù)合膠體顆粒。但是，歸因于40%的極性不帶電谷氨酰胺的存在以及麥醇溶蛋白的抗原性，小麥蛋白穩(wěn)定性易受影響[17]。

與蛋白質(zhì)相比，肽具有溶解性好，低抗原性和易吸收等特點(diǎn)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)一些具有兩親特性的蛋白水解產(chǎn)物同樣具有自組裝特性，可制備出膠束、納米管以及納米纖維等各種納米結(jié)構(gòu)體[18,19]，在作為輸送載體用于營(yíng)養(yǎng)輸送方面極具潛在價(jià)值，例如α例乳白蛋白的水解物[20]。小麥蛋白作為一種富含脯氨酸的兩親性蛋白，經(jīng)過(guò)酶解后獲得小麥蛋白水解物（Wheat Protein Hydrolysate，WPH），由于WPH中同樣富含大量的疏水性氨基酸和同其他疏水性小分子結(jié)合的能力，因此具有作為載體構(gòu)建膠體輸送體系的潛力。由此，本文試擬采用小麥蛋白為原料，通過(guò)酶解獲得兩親性多肽，構(gòu)建穩(wěn)定的槲皮素輸送體系，并且對(duì)該復(fù)合物的性質(zhì)及相互作用進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥谷朊粉，購(gòu)于美國(guó)Bob's Red Mill公司；胰蛋白酶(Trypsin)，購(gòu)于Sigma公司；分析測(cè)定所用各種化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；Version2.3 light自動(dòng)滴定儀，瑞士萬(wàn)通中國(guó)有限公司；OCA20視頻光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x，德國(guó) Dataphysics公司；Nano-ZS納米粒度分析儀和Mastersizer 3000+EV微米粒度儀，英國(guó)Malvern公司；Sonic Ruptor 400超聲細(xì)胞破碎儀，美國(guó)OMNI公司；F-7000熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥蛋白酶解物的制備

將小麥谷朊粉(5%，m/V)分散于水中，攪拌 30 min，預(yù)熱到37 ℃，用2 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)pH 到 8.0，加入 Trypsin，酶：底物=1：100(m/V)，于 37 ℃水浴中加熱，用自動(dòng)滴定儀滴定，保持溶液pH在8.0，酶解3 h后于95 ℃滅酶10 min后離心(10000 r/min，15 min)，上清液經(jīng)冷凍干燥后獲得酶解物樣品。

1.3.2 小麥蛋白酶解物的界面吸附能力

參考王金梅等[21]方法。采用 OCA20視頻光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定其汽水界面張力隨吸附時(shí)間t的變化以評(píng)估WPH的兩親特性。配置小麥蛋白酶解產(chǎn)物溶液（1、2、3、5 mg/mL），進(jìn)樣針取樣并組裝好進(jìn)樣裝置，用電動(dòng)注射裝置進(jìn)樣15 μL，視頻系統(tǒng)采集連續(xù)的液滴外形圖象，檢測(cè)界面張力隨吸附時(shí)間t的變化，測(cè)定時(shí)間為3 h，溫度為25 ℃。

1.3.3 小麥蛋白酶解物/槲皮素復(fù)合納米顆粒的制備

配制不同濃度 WPH 溶液(0、0.5、1、2、3、5 mg/mL，pH 7.0)，用無(wú)水乙醇配制Que溶液，Que溶液經(jīng)過(guò)反溶劑加入到 WPH溶液中，使 Que的終濃度為 133 μg/mL，輕輕搖動(dòng)即形成蛋白酶解物-Que復(fù)合物體系，靜置30 min后將少量沉淀進(jìn)行離心(10000 r/min，15 min)，上清液即為獲得的復(fù)合納米顆粒。通過(guò)測(cè)定槲皮素含量來(lái)確定其增溶效果。

1.3.4 Que荷載率的測(cè)定

用無(wú)水乙醇配制成不同濃度（0，2，4，6，8，10 μg/mL）Que溶液，用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)374 nm比色，得到線性回歸方程(Y=0.047X-0.0026，R2=0.9995)。將復(fù)合納米顆粒溶液樣品稀釋后于同樣條件下進(jìn)行比色，依據(jù)方程計(jì)算出溶解度。荷載率為Que溶解度同初始濃度（133 μg/mL）的比值。

1.3.5 復(fù)合納米顆粒的粒度測(cè)定

粒度測(cè)試于 25 ℃室溫下進(jìn)行，采用背散射技術(shù)(光散射角度為173 °)降低大顆粒的影響。利用光散射強(qiáng)度隨時(shí)間變化計(jì)算顆粒平均粒徑(Z-average)、多分散指數(shù)(PDI)及體積分布。平行測(cè)定三次。

1.3.6 顆粒形貌觀察

通過(guò)透射電子顯微鏡對(duì)Que納米顆粒的形貌進(jìn)行觀察。單純Que溶液為對(duì)照。將新鮮制備WPH-Que溶液稀釋至WPH濃度為5 μg/mL并置于400目的銅網(wǎng)上，待銅網(wǎng)自然干燥后再滴加磷鎢酸（0.5%，m/V）進(jìn)行染色5 min[22]，同樣除去液體后待自然干燥后進(jìn)行觀察。

1.3.7 熒光光譜

參考Chen等[23]方法并稍作修改。記錄小麥蛋白水解物(5 mg/mL)與一系列濃度的 Que(0～20 μg/mL)在10 mM磷酸緩沖液(pH 7.0)中的熒光發(fā)射光譜，以相應(yīng)濃度Que作為參比，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為310～500 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm，測(cè)定溫度為25 ℃。使用Stern-Volmer[24]方程進(jìn)行分析，計(jì)算Que納米顆粒的熒光淬滅速率常數(shù)。

1.3.8 X射線衍射(X-Ray Diffraction，XRD)

常溫條件下，將蛋白酶解液，水溶Que溶液以及復(fù)合納米顆粒溶液凍干，進(jìn)行XRD測(cè)定。測(cè)試指標(biāo)如下：采用D8 ADVANCE衍射器(德國(guó)Bruker公司)，銅靶Kα輻射（λ=0.15418 nm），LynxExe陣列探測(cè)器，狹縫DS=1 mm；RS=8 mm。采用Ni濾波片，管壓40 kV，管流40 mA，掃描波長(zhǎng)0.02度，掃描速度19.2秒/步。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次測(cè)定平均值，采用SPSS 16.0方差分析（ANOVA，Duncan）比較樣品平均值間的顯著差異(p＜0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 小麥蛋白酶解物的制備及自組裝能力

圖1 小麥蛋白酶解物在氣-水界面的表面張力隨吸附時(shí)間的變化Fig.1 Surface tension of WPH with a function of time at different concentrations

隨著時(shí)間的變化，小麥蛋白在胰蛋白酶作用下發(fā)生了限制性酶解，水解3 h后水解度僅有4.21%。這可能是由于小麥蛋白中麥谷蛋白和麥醇溶蛋白本身具有的水不溶性導(dǎo)致其不易被蛋白酶酶解。小麥蛋白的限制性酶解有利于獲得兩親性的多肽，過(guò)度的酶解可能導(dǎo)致酶解物表面活性的損失[25]。Joye和McClements研究發(fā)現(xiàn)[25]，相對(duì)于Alcalase酶解物而言，胰蛋白酶具有更低的水解度，但其乳化性較好，能夠較好的穩(wěn)定乳液液滴。本研究發(fā)現(xiàn)3 h蛋白酶解物能較好地穩(wěn)定槲皮素顆粒（結(jié)果未列出），后續(xù)研究采用其作為主要原料構(gòu)建復(fù)合納米顆粒。為了驗(yàn)證小麥蛋白酶解物是否具有較好的兩親性，研究了其在氣-水界面的表面張力隨吸附時(shí)間的變化，見(jiàn)圖1。

整體看，不同濃度蛋白酶解物的表面張力值均隨著吸附時(shí)間的增加而迅速減少，60 min吸附后，表面張力值下降趨勢(shì)趨于平緩。隨著酶解物濃度增加，表面張力下降速度加快。5 mg/mL酶解物經(jīng)過(guò)60 min吸附后，表面張力下降至41.81 mN/m。以上結(jié)果說(shuō)明小麥蛋白酶解物具有較好的表面吸附能力，兩親性多肽分子可以迅速地吸附到氣-水界面上。這可能與其具有的特殊重復(fù)疏水氨基酸結(jié)構(gòu)與序列有關(guān)。多肽的分子量不僅僅是決定其表面活性的唯一因素，其兩親性也具有重要作用[26]。Turgeon等[26]認(rèn)為，多肽至少要具有3～5個(gè)疏水氨基酸不連續(xù)的分布于2～3個(gè)極性氨基酸中間；并且指出2000的最小分子量對(duì)于良好的界面性質(zhì)是至關(guān)重要的，胰蛋白酶水解β-乳球蛋白(β-lgG)獲得的多肽都符合這一點(diǎn)。鑒于小麥蛋白酶解物具有一定的兩親性，利用多肽的自組裝特性荷載疏水活性物質(zhì)制備水溶性納米顆粒具有一定的可能性。

2.2 復(fù)合納米顆粒中槲皮素的增溶效果

圖2 不同濃度的小麥蛋白酶解物對(duì)Que溶解度的影響Fig.2 Effects of different concentrations of WPH on the water solubility of Que

小麥蛋白酶解物具有有效的增溶Que這一水溶性極差的疏水活性物質(zhì)的潛力。圖2為復(fù)合納米顆粒中Que的溶解度。未添加酶解物的槲皮素溶液出現(xiàn)大量的絮狀物，溶液較為渾濁，此時(shí)Que的溶解度僅為8 μg/mL。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[27]，Que在水中溶解度低于 1 μg/mL，說(shuō)明反溶劑過(guò)程可提高Que溶解度。王永輝等[28]也報(bào)道了此現(xiàn)象。隨著蛋白酶解物濃度的提高，溶液逐漸澄清透明，未見(jiàn)明顯的絮狀物。當(dāng)?shù)鞍酌附馕餄舛葹? mg/mL時(shí)，槲皮素含量高達(dá)126 μg/mL，說(shuō)明有94.74%的槲皮素荷載于復(fù)合納米顆粒中。蛋白酶解物的存在使得Que溶解度顯著（p＜0.05）提高了將近16倍。這可能與WPH具有一定的兩親性有關(guān)。Que與酶解物中的兩親性多肽可能發(fā)生了非共價(jià)相互作用，自組裝形成了復(fù)合納米顆粒，進(jìn)而對(duì)Que表現(xiàn)出良好的增溶效果。

2.3 復(fù)合納米顆粒的膠體性質(zhì)及穩(wěn)定性

WPH-Que復(fù)合納米顆粒的粒度分布如圖4所示。一般情況下，顆粒粒徑越小，則該顆粒的物理穩(wěn)定性越好。由圖3a可以看出，水溶液中的Que表現(xiàn)出了較寬的粒徑分布，粒徑從十幾微米到數(shù)百上千微米，平均粒徑達(dá)1800 nm，達(dá)到肉眼可見(jiàn)程度，這說(shuō)明游離的Que顆粒在水溶液中是極其不穩(wěn)定的。WHP-Que復(fù)合納米顆粒粒徑均在100 nm以下，當(dāng)酶解物濃度為5 mg/mL時(shí)，復(fù)合納米顆粒的平均粒徑只有75.71 nm，且粒度分布較均勻，只在10～100 nm范圍內(nèi)有單一峰，PDI值為0.419，具有良好的單分散性。此結(jié)果與溶解度結(jié)果一致（圖2）。

圖3 Que及WPH-Que復(fù)合物的粒度分布（a）和平均粒徑（b）Fig.3 Typical size distribution (a) and average size (b) of Que and WPH-Que nanoparticles

圖4 Que(a)、WPH-Que復(fù)合納米顆粒(b)的TEM圖(放大倍數(shù)分別為2.0k×，10.0k×)Fig.4 Typical TEM images of free Que (a) and WPH-Que nanoparticle (b) with 2.0 k× and 10.0 k× magnification,respectively

利用透射電子顯微鏡對(duì)游離Que和WPH-Que納米顆粒形貌進(jìn)行了觀察(圖5)。游離Que在水中形成了形狀不均勻的較大聚集體，呈緊實(shí)的團(tuán)聚狀態(tài)。而WHP-Que納米顆粒則呈現(xiàn)出均勻球形顆粒結(jié)構(gòu)，粒度均小于100 nm，與納米粒度分析結(jié)果一致（圖3）。另外，該納米顆粒具有較低的電子密度，說(shuō)明其結(jié)構(gòu)較為松散，可能是由WPH和Que共組裝而成的具有疏水空穴的復(fù)合膠束結(jié)構(gòu)。另外，納米顆粒周?chē)嬖谥S多黑色小顆粒，這可能是由于粒徑較小的Que聚集體吸附在WPH-Que顆粒表面造成的。

2.4 小麥蛋白酶解物/槲皮素的相互作用分析

圖5 不同Que濃度下的小麥蛋白酶解物的內(nèi)源熒光光譜（a）及其淬滅方程（b）Fig.5 Intrinsic fluorescence of WPH in the presence of different concentrations of Que (a) and its quenching equation (b)

圖6 小麥蛋白酶解物、槲皮素以及復(fù)合納米顆粒的X射線衍射Fig.6 The XRD of WPH, Que and WPH-Que nanoparticles

WPH在不同Que濃度下的熒光發(fā)射光譜如圖5a所示。隨著Que濃度的提高，WPH熒光強(qiáng)度逐漸降低，最大發(fā)射波長(zhǎng)未見(jiàn)明顯的變化。結(jié)果表明在不同濃度Que下，WPH中酪氨酸殘基周?chē)慕橘|(zhì)發(fā)生改變，可以判斷Que是通過(guò)疏水作用結(jié)合到酪氨酸殘基上的。

利用Stern-Volmer方程（圖5b）對(duì)所得數(shù)據(jù)分析WPH-Que相互作用誘導(dǎo)的熒光淬滅類(lèi)型。根據(jù)結(jié)果顯示，Kq與最大動(dòng)態(tài)淬滅常數(shù)2.0×1010M-1S-1比較，復(fù)合納米顆粒的淬滅常數(shù)小于最大淬滅常數(shù)，因此Que誘導(dǎo)的熒光淬滅可能存在動(dòng)態(tài)淬滅，兩者之間形成的復(fù)合物存在不穩(wěn)定的情況，具體的原因還需做進(jìn)一步的研究探討。

圖6是WPH、Que以及WPH-Que復(fù)合納米顆粒的X射線衍射。由圖可知，Que存在大量的晶體峰，而WPH和復(fù)合納米顆粒則無(wú)明顯的晶體峰出現(xiàn)，這表明游離的Que是以高度結(jié)晶狀態(tài)存在于水中的，經(jīng)過(guò)WPH形成復(fù)合納米顆粒后，轉(zhuǎn)化為無(wú)定型狀態(tài)，說(shuō)明Que和WPH形成了穩(wěn)定的具有無(wú)定型結(jié)構(gòu)的非共價(jià)復(fù)合物。

3 結(jié)論

本文采用胰蛋白酶對(duì)小麥蛋白水解可制備出高效酶解物，并利用WPH構(gòu)建了以Que為模型的復(fù)合納米顆粒膠體輸送體系，發(fā)現(xiàn)獲得的小麥蛋白肽表現(xiàn)出良好的界面活性以及在水中的膠束形成能力，二者能通過(guò)較強(qiáng)的非共價(jià)相互作用形成穩(wěn)定復(fù)合物。在WPH溶液中，Que的溶解度顯著提高，WPH對(duì)Que的荷載率高達(dá)94.7%。WPH-Que復(fù)合納米顆粒在水溶液中是以球形膠體顆粒的形式存在，并且顆粒分布比較均勻，較小的粒徑（＜100 nm）為WPH-Que復(fù)合納米顆粒良好的物理穩(wěn)定性提供了保證。WPH在以Que為代表的輸水活性物質(zhì)的膠體輸送中表現(xiàn)出巨大的潛力與價(jià)值。

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