基于?；詈推焚|(zhì)變化規(guī)律分析縊蟶(Sinonovacula constricta)貯藏過程中的代謝特性

胡園，李敏，方軍，鄭伊諾，曾國(guó)權(quán)，陸榮茂，柯愛英，朱潔

（浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江溫州 325005）

縊蟶(Sinonovacula constricta Lamarck)，俗稱蟶子、青子，隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)，瓣鰓綱(Lamellibranchia)，異齒亞綱(Heterodonta)，簾蛤目(Veneroida)，竹蟶科(Solenidae)、縊蟶屬(Sinonovaculla)，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、養(yǎng)殖周期短、產(chǎn)量高、肉質(zhì)鮮美和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，是我國(guó)四大傳統(tǒng)養(yǎng)殖貝類之一。因在采捕后，處于自然環(huán)境下極易腐敗變質(zhì)、口感迅速下降，失去食用價(jià)值，從而限制了縊蟶的鮮活銷售。另一方面，隨著人們對(duì)貝類食用的安全性和品質(zhì)要求的不斷提高，其新鮮度成為決定其價(jià)格的主要因素。新鮮度評(píng)價(jià)主要有感官評(píng)價(jià)、物理指標(biāo)、化學(xué)指標(biāo)和微生物檢測(cè)等方面[1,2]。活體保藏和運(yùn)輸已經(jīng)成為了貝類質(zhì)量和高值化研究的熱點(diǎn)。

國(guó)內(nèi)外已報(bào)道不同?；詈捅ｕr方式（冰溫保活、低溫保鮮、氣調(diào)保鮮、臭氧殺菌和生物保鮮涂覆劑等）下泥蚶Tegillarcula granosa[3]、文蛤Meretrix meretrix Linnaeus、波紋巴非蛤 Paphia undulata、近江牡蠣Crassostrea rivularis[4]和扇貝Nodipecten subnodosus[5]等貝類的理化指標(biāo)變化情況。但是，有關(guān)縊蟶的品質(zhì)研究起步較晚，對(duì)縊蟶在不同保鮮方式下理化指標(biāo)的研究也不全面。楊文鴿等[6]研究了縊蟶冰藏期間存活率及其呈味物質(zhì)（糖原、甜菜堿、游離氨基酸和AMP）的變化趨勢(shì)。高捷等[7,8]研究比較不同貯藏條件下的縊蟶糖原和乳酸變化。應(yīng)用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)研究了縊蟶冰溫?；钸^程中微生物多樣性變化[9]。因此，通過研究貯藏方式和重要脅迫因素對(duì)縊蟶生化代謝規(guī)律的影響，并從機(jī)理上闡述其腐敗、變質(zhì)、存活和品質(zhì)下降等原因，以及建立不同指標(biāo)的相關(guān)性，對(duì)進(jìn)一步優(yōu)化?；畋ｕr技術(shù)有著至關(guān)重要意義。本文研究了不同貯藏溫度（-4±1 ℃、0±1 ℃、5±1 ℃、10±1 ℃、25±1 ℃）下縊蟶存活率、基本營(yíng)養(yǎng)成分（水分、糖原、粗脂肪、粗蛋白和灰分）、生化特性（TVB-N、pH、肌原纖維蛋白巰基含量及Ca2+-ATPase酶活）和菌落總數(shù)指標(biāo)的變化規(guī)律，從而建立較為全面的貝類品質(zhì)評(píng)價(jià)體系（存活率、營(yíng)養(yǎng)代謝和生化指標(biāo)等），并在最優(yōu)貯藏溫度條件下延長(zhǎng)縊蟶的品質(zhì)和保證食用安全。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)儀器主要有電子天平CPA225D，賽多利斯科學(xué)儀器；冷藏冰柜SC-201F，江蘇白雪電器；馬弗爐EL-104，武漢元素科技發(fā)展；臺(tái)式PH計(jì)、高速離心機(jī)5810i，德國(guó) Eppendorf；游標(biāo)卡尺111N-101GA，廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司；可見分光光度計(jì) 722，上海欣茂儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與樣品采集

縊蟶于2016年3月采自浙江省寧海縣長(zhǎng)街養(yǎng)殖灘涂，活體帶回實(shí)驗(yàn)室，濕重9.30±1.44 g，殼長(zhǎng)62.1±3.4 mm。取大小相近、活力相當(dāng)?shù)目O蟶，根據(jù)溫度不同分為五組，分別為 25±1 ℃、10±1 ℃、5±1 ℃、0±1 ℃、-4±1 ℃，每組300個(gè)縊蟶用塑料框盛裝，每個(gè)溫度組3個(gè)平行，將浸泡過海水的雙層紗布蓋在縊蟶表面，并隔天噴海水以保持 100%濕度環(huán)境。定期核查記錄不同溫度條件貯藏的實(shí)際溫度。定期取樣測(cè)定不同溫度條件貯藏縊蟶的微生物和理化指標(biāo)。

1.3 檢活方法

每天隨機(jī)取不同溫度條件貯藏 30只大小相近的縊蟶置于常溫海水靜置1 h后，采用目測(cè)法檢活，即刺激貝體或其入水管、出水管，貝殼能自由閉合或水管自由伸縮者為活體，否則為死貝。

成活率=活蟶子個(gè)數(shù)/(活蟶子個(gè)數(shù)+死蟶子個(gè)數(shù))×100%

1.4 基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

隨機(jī)取約30個(gè)活縊蟶，去殼取肉，用中性濾紙吸干表面水分，用高速組織搗碎機(jī)將肉搗碎后，于-20 ℃保存，用于縊蟶營(yíng)養(yǎng)成分分析。

水分測(cè)定采用恒溫常壓干燥法《GB 5009.3-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》；粗蛋白測(cè)定采用微量凱氏定氮法（《GB 5009.5-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》）；粗脂肪測(cè)定采用索氏抽提法（《GB/T 14772-2008食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》）；灰分測(cè)定采用馬弗爐灼燒法《GB 5009.4-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》；糖原測(cè)定按照南京建成生物工程研究所糖原測(cè)定試劑盒的操作說明測(cè)定糖原的含量。

1.5 pH測(cè)定

縊蟶去殼取肉，稱取10.0 g，加入100 mL無氨蒸餾水，置于恒溫?fù)u瓶柜中不時(shí)搖勻，靜置30 min后低溫離心。取上清液50 mL，按酸度計(jì)法操作，用精密pH計(jì)測(cè)定。

1.6 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）

揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定根據(jù)《GB 5009.228-2016食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》方法進(jìn)行測(cè)定。

1.7 菌落總數(shù)

菌落總數(shù)根據(jù)《GB 4789.2-2016食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)》進(jìn)行測(cè)定。取10個(gè)縊蟶去殼取肉，稱取5.0 g，用滅菌剪刀剪碎放于50 mL滅菌生理鹽水中，勻質(zhì)，制作成1：10的均勻稀釋液。然后選擇合適的三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做二個(gè)平行樣，用營(yíng)養(yǎng)瓊脂倒平板的方法來測(cè)定菌落總數(shù)。在36±1 ℃培養(yǎng)48 h±2 h，平板計(jì)數(shù)以每克樣品的菌落總數(shù)（Log CFU/g）表示。

1.8 肌原纖維蛋白巰基蛋白含量和Ca2+-ATPase酶活力

縊蟶去殼取肉，剪碎后稱取1 g，加入15 mL預(yù)冷的0.60 M KCl-磷酸緩沖溶液勻漿，冷凍離心9500 r/min，30 min，取上清液，加入3倍預(yù)冷的雙蒸水，搖勻，冷凍離心9500 r/min，30 min，棄上清液，沉淀用預(yù)冷的0.60 M KCl-Tris緩沖溶液溶解，用力搖勻，冷凍離心9500 r/min，30 min，取上清液，即為肌原纖維蛋白液[10]。

1.8.1 肌原纖維蛋白巰基蛋白含量

按照南京建成生物工程研究所巰基蛋白含量測(cè)定試劑盒的操作說明測(cè)定巰基蛋白的含量（μmol/g）。

1.8.2 肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase酶活力

按照南京建成生物工程研究所測(cè)定 Ca2+-ATPase酶活力試劑盒的操作說明測(cè)定 Ca2+-ATPase活力（U/mg）。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，取其平均值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S)”表示，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度對(duì)縊蟶存活率的影響

不同溫度條件下貯藏縊蟶的存活率見圖 1。結(jié)果表明，貯藏在25±1 ℃（常溫）條件下，縊蟶在第3 d后全部死亡，貯藏在（-4±1）℃條件下，縊蟶在第1 d后存活率急劇下降到50%，說明環(huán)境溫度對(duì)離水貝類的存活影響較大，溫度越高，貝體內(nèi)耗能隨著增大，促使代謝消耗，存活率也會(huì)降低；而過低的溫度會(huì)造成貝體出現(xiàn)微凍結(jié)甚至完全凍結(jié)，加快貝類死亡，都達(dá)不到?；畹淖饔?。

Youko[11]為了延長(zhǎng)貝類存活時(shí)間，通過將貝類的溫度控制在特定的冰溫帶范圍，使貝類進(jìn)入休眠狀態(tài)以維持其組織細(xì)胞活性。縊蟶的生態(tài)冰溫區(qū)大致為-1.3 ℃至 2.8 ℃[12]，本研究中，貯藏在（0±1）℃、（5±1）℃和（10±1）℃條件下，縊蟶分別在11 d、7 d、5 d存活率達(dá)到95%以上，其中，（0±1）℃貯藏的縊蟶處于生態(tài)冰溫帶范圍，具有最高的成活率。

2.2 不同貯藏溫度對(duì)縊蟶肌肉基本營(yíng)養(yǎng)組分含量的影響

不同貯藏溫度下，縊蟶的水分、粗蛋白、粗脂肪、糖原和灰分等基本營(yíng)養(yǎng)成分含量的變化如圖 2。結(jié)果表明，隨著?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)，縊蟶水分含量變化不顯著，不同溫度貯藏組的縊蟶水分含量變化相差不大。

圖2 不同溫度條件下貯藏縊蟶基本營(yíng)養(yǎng)含量的變化Fig.2 The changes of basic nutritional composition of Sinonovacula constricta under different storage temperatures

(-4±1) ℃、(0±1) ℃、(5±1) ℃、(10±1) ℃貯藏 11 d后水分含量下降了約6.02%～8.49%；而(25±1) ℃?；? d后水分含量從 80.08%下降到 76.60%，下降了約4.35%。縊蟶體內(nèi)水分的含量和分布及存在形式對(duì)其質(zhì)地、風(fēng)味和貯藏性能等方面都存在影響。考慮到縊蟶在完全干露條件下，容易出現(xiàn)體表及外露水管、斧足干燥，本研究采用雙層紗布對(duì)縊蟶進(jìn)行保濕處理，不同溫度條件貯藏縊蟶體內(nèi)水分含量下降趨勢(shì)差異較少，故水分蒸發(fā)和流失的現(xiàn)象不嚴(yán)重。雙層紗布保活菲律賓蛤仔的方式能夠保持其濕潤(rùn)度，延長(zhǎng)保活時(shí)間和提高存活率[13]。海泥裹覆、羧甲基纖維素鈉（CMC）和褐藻酸鈉等方式能使縊蟶表面保持濕度和透氧作用[14]。

貝類?；钸^程中主要營(yíng)養(yǎng)成分能否很好地保持是衡量保活效果的重要指標(biāo)之一[15]。不同溫度條件下貯藏縊蟶的粗蛋白含量基本保持穩(wěn)定，粗脂肪、糖原和灰分呈下降趨勢(shì)。不同溫度貯藏11 d后糖原下降幅度約為54.86%～69.45%，貯藏溫度越低縊蟶體內(nèi)糖原下降幅度越小。不同溫度貯藏11 d后脂肪下降幅度約為21.69%～28.92%，其中（0±1）℃貯藏條件下的縊蟶脂肪含量下降幅度較其它保活組較平緩。但是不同溫度貯藏11 d后蛋白質(zhì)下降幅度較少約為3.00%～6.77%。說明蛋白質(zhì)充當(dāng)機(jī)體的結(jié)構(gòu)和功能性物質(zhì)，不作為能量?jī)?chǔ)備物質(zhì)。在22 ℃和27 ℃條件下，經(jīng)過15周的饑餓應(yīng)激后蛤蜊Mesodemsma mervenaria蛋白質(zhì)含量減少，而牡蠣Crassostrea virginica蛋白質(zhì)水平?jīng)]有受到影響[16]。綜上所述，不同溫度條件貯藏縊蟶的基本營(yíng)養(yǎng)成分含量減少量高低依次均為糖原、粗脂肪、粗蛋白，在不能攝食時(shí)，不斷消耗能量物質(zhì)以糖原為主粗脂肪為輔。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，縊蟶體內(nèi)脂肪的分解代謝加強(qiáng)并且作為加強(qiáng)糖原異生途徑的原料[17]。申淑琦等[18]采用充氧保濕處理4 ℃無水?；钸^程中，海灣扇貝Argopecten irradians消耗能量物質(zhì)的基本營(yíng)養(yǎng)成分先后順序一致。

（0±1）℃，（5±1）℃和（10±1）℃貯藏11 d 后灰分下降幅度約為 20.53%～24.71%，其中（-4±1）℃貯藏的縊蟶處于微凍環(huán)境下，灰分含量從1.54%下降到1.53%，下降幅度約為0.65%。其中，（-4±1）℃貯藏過程中的縊蟶因低溫造成了貝體微凍而死亡，其體內(nèi)的灰分含量變化不大，而其它不同?；顪囟冉M的縊蟶肌肉灰分含量下降了18.10%～24.70%。這可能是因?yàn)榭O蟶在?；钸^程中，機(jī)體排泄或體液的流失，使機(jī)體礦物質(zhì)流失。

隨著不同溫度條件貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，縊蟶的水分和粗蛋白含量基本保持穩(wěn)定，其機(jī)體的能量消耗以糖原為主脂肪為輔，除（-4±1）℃貯藏的縊蟶處于微凍環(huán)境下，灰分下降幅度較小，其它貯藏溫度條件下的縊蟶有一定的礦物質(zhì)流失。

2.3 不同貯藏溫度對(duì)縊蟶生理生化指標(biāo)影響

2.3.1 pH

貝類pH值的變化是受不同代謝產(chǎn)物共同影響的結(jié)果，其值反映貯藏過程中貝類新鮮度的趨勢(shì)?；钇坟愵惖膒H一般處于6.3～7.5之間，捕后立即測(cè)定pH一般為 7.0～7.3[19]。不同溫度條件下貯藏過程中縊蟶pH值的變化如圖3所示。結(jié)果表明，不同溫度貯藏的縊蟶肌肉pH初始值為7.0，之后逐漸下降，至第3 d為最低，而后又開始上升。最終，（-4±1）℃和（25±1）℃組的縊蟶 pH 值低于 7.0，而無水保活組（0±1 ℃、5±1 ℃、10±1 ℃）的縊蟶pH值高于7.0。其中，（0±1）℃、（5±1）℃和（10±1）℃?；畹暮? d，pH值變化相對(duì)比較緩慢。

圖3 不同溫度條件下貯藏過程中縊蟶pH的變化Fig.3 The changes of pH value of Sinonovacula constricta under different storage temperatures

2.3.2 揮發(fā)性鹽基氮含量

圖4 不同溫度條件下貯藏縊蟶TVBN的變化Fig.4 The changes of TVB-N value of Sinonovacula constricta under different storage temperatures

揮發(fā)性鹽基氮（Total volatile basic nitrogen，TVB-N）廣泛作為判斷水產(chǎn)品新鮮度，并且針對(duì)蛋白含量較高的貝類其靈敏度較高，TVB-N含量越低，產(chǎn)品新鮮度越高[20]。我國(guó)對(duì)海產(chǎn)貝類的TVB-N含量可接受限為≤15 mg/100 g[21]。不同溫度條件下貯藏縊蟶TVB-N值變化的影響如圖4所示。結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度組的縊蟶TVB-N值均逐漸增大。貯藏溫度越高，縊蟶TVB-N值增加的趨勢(shì)越明顯。不同溫度(-4±1 ℃、0±1 ℃、5±1 ℃、10±1 ℃、25±1 ℃)貯藏期間，分別在 11 d、9 d、7 d、5 d 和 2 d縊蟶TVBN值接近海水貝類最大可接受限值。

2.3.3 肌原纖維蛋白巰基含量和 Ca2+-ATPase酶活力

肌原纖維蛋白是肌肉蛋白的主要成分，不僅對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性起著決定性作用并直接影響其品質(zhì)，并且以肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白為主的肌原纖維蛋白參與生理代謝，同時(shí)肌動(dòng)球蛋白的 ATPase活性變化和肌原纖維蛋白在內(nèi)源或外源性酶的作用下水解[22]等。不同溫度條件下貯藏過程中縊蟶肌原纖維蛋白巰基含量和Ca2+-ATPase活性的變化如圖5和圖6所示。

圖5 不同溫度條件下貯藏縊蟶肌原纖維蛋白巰基含量的變化Fig.5 The changes of SH content of myofibrillar protein of Sinonovacula constricta under different storage temperatures

圖6 不同溫度條件下貯藏縊蟶肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase酶活性的變化Fig.6 The changes of Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein of Sinonovacula constricta under different storage temperatures

縊蟶肌原纖維巰基蛋白含量初始值 246.40 μmol/g～308.35 μmol/g，肌原纖維 Ca2+-ATPase 酶活1.141 U/mg～2.111 U/mg。在(-4±1) ℃、(0±1) ℃、(5±1) ℃、(10±1) ℃貯藏組的前5 d縊蟶Ca2+-ATPase酶活出現(xiàn)較大幅度降低，其下降幅度為34.90%～50.00%；而后5 d平緩得下降，其下降幅度為2.30%～35.60%。同樣，不同溫度條件下貯藏縊蟶肌肉的肌原纖維蛋白巰基含量具有相同的趨勢(shì)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度條件貯藏縊蟶肌肉的肌原纖維蛋白巰基含量和Ca2+-ATPase活性均有下降趨勢(shì)，但不同溫度組差異不顯著（p＞0.05）。巰基是魚肉蛋白中最有反應(yīng)活性的功能性基團(tuán)，肌球蛋白分子中含有活性巰基SH1和SH2與肌球蛋白的Ca2+-ATPase活性密切相關(guān)[10]。Koichi Kuwahara等人研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的檸檬酸鈉能抑制鯉魚肌原纖維蛋白變性、抑制肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的下降，保護(hù)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，提高鯉魚的保水性[23]。吳忠等[24]研究表明活品蝦夷扇貝閉殼肌和外套膜肌原纖維蛋白的 ATPase活性（Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase）與肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性具有相關(guān)性，在酸性條件下對(duì)肌肉蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的破壞更明顯。

2.4 菌落總數(shù)

圖7 不同溫度條件下貯藏縊蟶菌落總數(shù)的變化Fig.7 The changes of total bacterial count of Sinonovacula constricta under different storage temperatures

為獲得鮮活縊蟶的衛(wèi)生狀況和食用安全性，菌落總數(shù)高低不僅能反映新鮮程度，而作為食品被微生物污染程度指標(biāo)。根據(jù)我國(guó)貝類投放市場(chǎng)微生物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的要求，菌落總數(shù)不得高于5×104CFU/g[25]。不同溫度條件貯藏過程中縊蟶菌落總數(shù)變化如圖7所示。

研究表明，在(0±1) ℃、(4±1) ℃、(10±1) ℃、(25±1) ℃溫度條件下，當(dāng)分別達(dá)到7 d、5 d、3 d、2 d時(shí)，縊蟶的菌落總數(shù)接近4.7 log(CFU/g)。隨著?；顣r(shí)間延長(zhǎng)和溫度升高的雙重作用，菌落總數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。而(-4±1) ℃貯藏期間，縊蟶菌落總數(shù)始終低于 4.7 log(CFU/g)，其主要原因隨著低溫微凍貯藏過程中大部分細(xì)菌很快死亡。本研究發(fā)現(xiàn)(-4±1) ℃和(0±1) ℃組的縊蟶 TVB-N值增加的幅度不大，由于溫度低，微生物的增殖受到一定的抑制，減緩蛋白質(zhì)的分解和氨及胺類堿性含氮物質(zhì)的產(chǎn)生，從而達(dá)到減緩縊蟶鮮度下降的趨勢(shì)。菲律賓蛤仔 TVB-N的變化與低溫保藏過程中微生物的增長(zhǎng)狀況存在一定的相關(guān)性[26]。楊華等[27]研究以殼聚糖作為保鮮劑在冰藏條件下能夠很好地抑制縊蟶機(jī)體TVB-N、pH和菌落總數(shù)等生化指標(biāo)的變化。

3 結(jié)論

在一定濕度的條件下合理降低貯藏溫度能夠延長(zhǎng)縊蟶的存活率，(0±1) ℃貯藏的縊蟶具有較高的成活率，在11 d存活率達(dá)到95%以上。通過不同貯藏溫度對(duì)縊蟶機(jī)體基本營(yíng)養(yǎng)組成含量高低比較，縊蟶能量消耗以糖原為主粗脂肪為輔。并且(0±1) ℃貯藏條件下的縊蟶脂肪含量下降幅度較其它保活組較平緩。?；顣r(shí)間延長(zhǎng)和溫度升高的雙重作用，縊蟶菌落總數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在第7 d接近4.7 log(CFU/g)。而縊蟶肌肉肌原纖維蛋白巰基含量和Ca2+-ATPase活性均有下降趨勢(shì)。

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