滲透脅迫對云南松幼苗生物量及碳酸酐酶的影響

王曉麗，李文靜，張志強，曾仰君，曹子林

(1.西南林業(yè)大學 林學院，云南 昆明 650224；2.昭通市林業(yè)有害生物監(jiān)測檢驗中心，云南 昭通 657000；3.西南林業(yè)大學 環(huán)境科學與工程學院，云南 昆明 650224)

云南地處中國西南石漠化中心地區(qū)，是中國巖溶分布最廣的省區(qū)之一。巖溶發(fā)育，往往導致土壤表層干旱缺水、土壤淺薄貧瘠(缺磷少氮)、巖石裸露、地形破碎、生態(tài)環(huán)境脆弱[1-4]，已成云南巖溶地區(qū)最大的生態(tài)環(huán)境問題。在巖溶區(qū)，根據基巖裸露率、坡度、土壤厚度、土被覆蓋度、土被加植被蓋度等因子，將石漠化劃分為無明顯石漠化、潛在石漠化、輕度石漠化、中度石漠化、重度石漠化、極度石漠化六個等級[5]。云南松(Pinusyunnanensis)林是我國西南地區(qū)特有的森林植被類型，同時也是云南省主要森林類型[6]，其天然林主要分布區(qū)的石漠化等級為無明顯石漠化、潛在石漠化、輕度石漠化和中度石漠化，由此可見，云南松與巖溶生境具有協(xié)同適應性。

在巖溶地區(qū)，人們已經認識到植被對巖溶發(fā)育具有強大的驅動力。有報道認為碳酸酐酶(carbonic anhydrase,簡稱CA)對碳酸鹽巖的溶解具有催化作用，在巖溶動力系統(tǒng)中加入CA可使石灰?guī)r的溶解速率提高10倍[7-12]；云南松體內的CA在巖溶生境中具有良好的穩(wěn)定性以及云南松體內CA活性與林內土壤中CA活性存在極顯著的相關性[13-14]；硅藻[15]分泌的CA能促進石灰?guī)r的溶蝕，因此，植物體內CA在生物巖溶發(fā)育過程中扮演著重要的角色。另外，研究發(fā)現(xiàn)CA在光合作用途徑的碳固定中起著重要的作用，可加速無機碳向羧化酶活性部位的擴散，增加CO2的固定速率[16]；巖溶區(qū)玉米[17]葉片的CA活性和光合作用也高于非巖溶區(qū)；CA活性高低對植物水分利用及光合作用都有較大影響，干旱脅迫下番茄CA活性變化對植株光合作用及水分利用的影響研究[18]表明番茄葉水勢和光合速率與CA表達活性之間存在一定的變化趨勢相似性；CA可看作植物適應干旱脅迫[18-20]、鹽脅迫[21]、低溫脅迫[22]等脅迫條件的光合碳代謝調節(jié)酶,在保持光合碳代謝穩(wěn)定方面具有重要功能。綜上所述，CA在植物生物巖溶和逆境適應性方面皆具有重要的作用，生物巖溶和逆境適應性是巖溶地區(qū)植被恢復及石漠化治理研究的核心內容，所以可將CA研究作為一個重要的切入點，開展云南巖溶生境條件下植被CA活性及其生物巖溶作用機制的相關研究，為云南巖溶地區(qū)植被恢復及石漠化治理提供了一種新的理論視角，是解決云南巖溶地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)恢復與重建的重要途徑。

目前，以云南巖溶生境的云南松林為研究對象，對云南松CA在巖溶生境中的穩(wěn)定性和云南松CA活性及其與林內土壤中CA活性的相關性做了一些基礎性的前期研究工作[13-14]。但是，關于巖溶環(huán)境因子對云南松CA活性的影響、巖溶生境下云南松CA活性的變化規(guī)律以及與CA活性密切相關的云南松生長指標研究卻缺乏，不僅制約人們對云南松巖溶環(huán)境適應性及其生物巖溶作用機制的理解，而且不利于云南松天然林可持續(xù)發(fā)展、石漠化生態(tài)恢復等實踐活動。本文以置床第31天的云南松幼苗為試驗材料，通過PEG滲透處理模擬干旱脅迫的方式，研究干旱脅迫(主要巖溶環(huán)境因子之一)對云南松幼苗生物量和CA活性的影響，探討云南松幼苗生物量及CA活性隨主要巖溶環(huán)境因子的變化規(guī)律，以CA為切入點，分析云南松幼苗的巖溶生境適應性和其生物巖溶作用機制。為現(xiàn)有云南松天然林的可持續(xù)發(fā)展和云南松人工林的定向培育提供理論依據和技術支撐，同時豐富我國巖溶生態(tài)系統(tǒng)良性生態(tài)恢復的機理研究。

1 材料與方法

1.1 材料

以云南松幼苗為試驗材料，云南松種子來自于楚雄雙柏。

1.2 方法

1.2.1 幼苗模擬干旱脅迫(滲透脅迫)處理 將云南松種子置于底部墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中放置100粒種子，每天開蓋通氣，定期對每個培養(yǎng)皿補充等量的水分，置床第21天發(fā)芽結束；置床第24天，采用兩因素四水平的正交試驗設計(表1、表2)，利用PEG6000模擬干旱脅迫對幼苗進行干旱處理，每個處理組合4個培養(yǎng)皿，設置64個培養(yǎng)皿；置床第31天，對所有處理統(tǒng)一取樣，測定幼苗的生物量和碳酸酐酶活性。

1.2.2 試驗材料取樣方法 幼苗生物量測定的取樣方法，每個處理組合隨機取60株生長正常，沒有霉壞的云南松幼苗，將整株幼苗按根、莖、葉分開成3個部分，20株為1個重復，設3個重復，備用。碳酸酐酶活性測定取樣方法，每個處理組合隨機取4 g生長正常，沒有霉壞的云南松幼苗，設3個重復，備用。

1.2.3 碳酸酐酶提取 每個處理3個重復，每個處理取新鮮的云南松幼苗4 g，放入預冷的研缽中，加入液氮，再加入3 mL的巴比妥提取緩沖溶液(10 mmol/L，含巰基乙醇50 mmol/L，pH=8.3)進行研磨，將研磨液倒入2 mL的離心管中，置于冰浴中20 min后，在4℃條件下用13 000 r/min離心5 min，取上清液裝在2 mL的離心管里冷藏備用[13-14]。

表1 試驗的因素水平

表2 模擬干旱脅迫(滲透脅迫)處理強度和處理時間的L16(45)正交試驗設計

1.2.4 碳酸酐酶活性測定 云南松幼苗碳酸酐酶活性的測定采用pH計法[13-14]。保持反應系統(tǒng)在0～2℃，取待測粗提液1 mL，加入到含15 mL的巴比妥緩沖液(20 mmol/L，pH8.3)的反應容器中，然后迅速加入10 mL預冷的(0～2℃)飽和CO2蒸餾水，用pH電極監(jiān)測反應體系pH值的變化，記下pH下降1個單位(8.2～7.2)所需時間，記為te，同時記錄同一樣品在酶失活條件下pH下降1個單位所需的時間，記為t0，酶的活性用WA-unit表示[13-14]。WA=(te/t0-1)。酶相對活性：(活性/對照活性)×100%。

1.2.5 數據分析 運用SPSS軟件進行方差分析和多重比較(Duncan氏新復極差法)[23-25]。

2 結果與分析

2.1 模擬干旱脅迫(滲透脅迫)對云南松幼苗生物量的影響

2.1.1 模擬干旱脅迫(滲透脅迫)對云南松幼苗生物量鮮重的影響 不同滲透脅迫處理對云南松幼苗根、莖、葉及總生物量鮮重影響的變化趨勢基本相同，即隨著滲透脅迫程度的加深(模擬干旱處理的PEG6000濃度的增大和處理時間的延長)，生物量鮮重總體上皆呈現(xiàn)下降的趨勢(圖1)。但處理組合13(30%的PEG6000處理1 d)的莖生物量為3.835 g，高于其他的處理組合(包括對照)，且處理組合13的葉生物量(5.224 g)及總生物量(10.706 g)略低于對照但高于其余的處理組合，而處理組合13的根生物量(1.647 g)則是下降的，說明大強度短時間的滲透脅迫對根生長的影響大于其對莖和葉的影響。隨著大強度滲透脅迫時間的延長，抑制效應在器官間表現(xiàn)均衡，且幼苗各器官生物量受到的抑制作用更強。

2.1.2 模擬干旱脅迫(滲透脅迫)對云南松幼苗鮮重生物量分配的影響 在不同滲透脅迫處理情況下，云南松幼苗根、莖、葉不同器官生物量排序皆表現(xiàn)為葉>莖>根；且云南松幼苗的葉生物量所占總生物量的比重在46%～53%，莖生物量所占總生物量的比重在26%～36%，根生物量所占總生物量的比重在15%～23%。由此可知，模擬干旱脅迫條件下，云南松幼苗不同器官生物量的分配中，根、莖、葉的占比排序為葉>莖>根，且該占比排序不會隨著滲透脅迫強度的增大和時間的延長出現(xiàn)很大的波動，基本保持一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)(圖2)。在不同滲透脅迫處理中，處理5(10%的PEG6000處理1 d)、6(10%的PEG6000處理3 d)、7(10%的PEG6000處理5 d)、8(10%的PEG6000處理7 d)中根生物量所占總生物量的比例皆基本與對照持平，處理9(20%的PEG6000處理1 d)中根生物量所占總生物量的比例最高，為23.29%，處理10(20%的PEG6000處理3 d)、11(20%的PEG6000處理5 d)、12(20%的PEG6000處理7 d)、13(30%的PEG6000處理1 d)、14(30%的PEG6000處理3 d)、15(30%的PEG6000處理5 d)、16(30%的PEG6000處理7 d)中根生物量所占總生物量的比例皆呈現(xiàn)下降的情況，說明根對滲透脅迫強度的增大和時間的延長更為敏感，在處理9的作用強度和時間條件下，云南松幼苗對根占比的調整更有利于其抗逆能力的提高，更高的脅迫強度和更長的脅迫時間不利于云南松幼苗從生物量分配調整方面增強其抗逆能力。

2.2 模擬干旱脅迫(滲透脅迫)對云南松幼苗碳酸酐酶相對活性的影響

在滲透脅迫下，云南松幼苗碳酸酐酶相對活性隨著滲透脅迫強度的增大和時間的延長呈先增強后減弱的趨勢(表3)。在不同滲透脅迫處理中，所有的脅迫處理組合作用的云南松幼苗的碳酸酐酶相對活性皆大于對照，且處理11(20%的PEG6000處理5 d)中云南松幼苗碳酸酐酶相對活性最大，為86.5%。為進一步認識滲透脅迫不同處理組合對云南松幼苗碳酸酐酶相對活性影響的差異顯著性，對各處理組合間的碳酸酐酶相對活性進行了單因素方差分析(表3)，結果P≈0.000<0.01，表明處理組合間的碳酸酐酶活性存在極顯著差異，因此進而對各處理組合間的碳酸酐酶相對活性做多重比較(表3)，結果表明4個對照處理(處理組合1、2、3、4)(記作C組)間碳酸酐酶相對活性不存在顯著差異，同時處理組合8、9、10、11、12、13(記作A組)間的碳酸酐酶相對活性不存在顯著差異，但A組皆極顯著的大于處理組合6和16(記作B組)的碳酸酐酶相對活性，且A組和B組皆極顯著的大于C組的碳酸酐酶相對活性，處理組合7、14、15(記作AB組)是A組與B組間的過渡組，處理組合5和2(記作BC組)是B組合C組間的過渡組。在滲透脅迫下，云南松幼苗碳酸酐酶相對活性隨著滲透脅迫強度的增大和時間的延長呈現(xiàn)出先逐漸增大(增大效果由差異不顯著到差異極顯著)到峰值后再逐漸減小(減小效果由差異不顯著到差異極顯著)的情況，表明模擬干旱脅迫(滲透脅迫)誘導了碳酸酐酶相對活性的增強，有利于提高云南松幼苗的抗逆能力，但其碳酸酐酶相對活性增強幅度受制于模擬干旱脅迫(滲透脅迫)的作用強度和延續(xù)時間。

表3 不同處理組合模擬干旱脅迫(滲透脅迫)對云南松幼苗碳酸酐酶相對活性影響的描述統(tǒng)計、方差分析與多重比較

注：P<0.01，**表示差異極顯著。表4同。

對影響云南松幼苗碳酸酐酶相對活性的滲透脅迫各處理組合因素的水平間的極差分析和方差分析表明，影響碳酸酐酶相對活性的主次因子的排序是A>B>A×B(RA=16.56%>RB=2.20%>RA×B=1.90%)，因素A(PEG6000的濃度)的水平間對酶活性具有極顯著的影響(PA≈0.000<0.01)；因素B(處理天數)的水平間對酶活性沒有顯著的影響；滲透脅迫處理強度和處理時間的交互作用對酶活性強度沒有顯著的影響；因素A水平間的多重比較結果，X3(記作A組)極顯著地大于X2和X4(記作B組)及X1(記作C組),X2和X4(記作B組)極顯著地大于X1(記作C組)(表4)，說明干旱脅迫強度對酶活性有極顯著的影響，酶活性隨著處理液濃度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的情況，X3(20%的PEG6000)所產生的模擬干旱脅迫(滲透脅迫)強度應該是云南松調節(jié)碳酸酐酶活性提高抗逆能力的轉折點。

表4 模擬干旱脅迫(滲透脅迫)因素水平間碳酸酐酶相對活性的方差分析和極差分析

3 結論與討論

不同模擬干旱脅迫(滲透脅迫)處理對云南松幼苗根、莖、葉及總生物量鮮重影響的變化趨勢基本相同，即隨著干旱脅迫程度的加深，生物量鮮重總體上皆呈現(xiàn)下降的趨勢，同時大強度短時間的滲透脅迫對根生長的影響大于其對莖和葉的影響，這與滲透脅迫對云南松幼苗不同器官鮮重生物量的分配影響的研究結果一致。在處理9的作用強度和時間條件下，云南松幼苗根的生物量占比最大，有利于增強幼苗對水分、養(yǎng)分的吸收。因此幼苗對根占比的調整更有利于其抗逆能力的提高，更高的脅迫強度和更長的脅迫時間不利于云南松幼苗從生物量分配調整方面增強其抗逆能力。

在模擬干旱脅迫(滲透脅迫)下，云南松幼苗碳酸酐酶活性隨著滲透脅迫強度的增大和時間的延長呈先增強后減弱的趨勢。在不同滲透脅迫處理中，所有的脅迫處理組合作用的云南松幼苗的碳酸酐酶活性皆大于對照，且處理11中云南松幼苗碳酸酐酶活性最大。結合滲透脅迫對云南松幼苗根生物量占比的調整結果來看，當滲透脅迫程度進一步加大時(由處理9到處理11)，云南松幼苗已無法通過調整生物量的分配策略增強其抗逆能力，但云南松幼苗仍可通過增大碳酸酐酶活性，增強其固碳和光合作用能力，以及通過碳酸酐酶在根際土壤中的積累促進巖溶生境土壤中CO2的釋放和富集增強幼苗的光合作用，來增強云南松幼苗對巖溶生境的適應能力和其改良巖溶生境的生物巖溶作用。因此，模擬干旱脅迫誘導了碳酸酐酶活性的增強，有利于提高云南松幼苗的抗逆能力，但其碳酸酐酶活性增強幅度受制于干旱脅迫的作用強度和延續(xù)時間。

影響碳酸酐酶活性的主要因子是因素A(PEG6000的濃度)，因素A水平間對酶活性具有極顯著的影響；因素B(處理天數)、因素A×B(模擬干旱處理強度和處理時間的交互作用)的水平間對酶活性皆沒有顯著的影響；模擬干旱脅迫(滲透脅迫)強度對酶活性有極顯著的影響，酶活性隨著處理液濃度的升高呈先升高后下降的情況，X3(20%的PEG6000)所產生的模擬干旱脅迫(滲透脅迫)強度應該是云南松調節(jié)碳酸酐酶活性提高抗逆能力的轉折點。

受研究時間和試驗材料的限制，本文僅以云南松發(fā)芽后的幼苗為研究材料，由于模擬干旱脅迫(滲透脅迫)處理時間整體較短，因此在不同器官生物量分配研究方面有一定的局限性(由于幼苗太小，生物量太少，所以本研究采用了鮮重指標，而沒有采用干重指標。)，研究結論只代表了該階段的不同器官生物量分配策略，后續(xù)隨著苗木的生長和林木的發(fā)育，其不同生長階段在干旱脅迫中的生物量分配策略還有待進一步的深入研究，才能比較全面地認識云南松的干旱脅迫的生物量分配策略。另外，干旱脅迫雖然是巖溶生境的主要環(huán)境因子，但巖溶生境同時還存在土壤淺薄貧瘠(缺磷少氮)的問題，因此后續(xù)可開展土壤理化性質對云南松生長和碳酸酐酶活性影響方面的研究，綜合分析巖溶生境中云南松的適生策略，為進一步篩選適應不同等級石漠化區(qū)域的優(yōu)良云南松單株、家系或無性系提供理論依據和技術支撐。

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