土壤中棉花黃萎病菌微菌核的定量檢測(cè)*

羅舒文，劉 龍，劉 政，任毓忠*，李國(guó)英

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832003；2新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花研究所/農(nóng)業(yè)部西北內(nèi)陸區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

棉花黃萎病是典型的土傳病害，屬于維管束的系統(tǒng)性真菌病害，給棉花產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的影響[1]。引起我國(guó)棉花發(fā)生黃萎病害的病原菌為大麗輪枝菌（Verticillium dahliae kleb）[2]。根據(jù)棉花黃萎病菌的致病型，一般可將其劃分為落葉型和非落葉型2種致病型[3]。研究發(fā)現(xiàn)，落葉型菌系的致病性強(qiáng)于非落葉型菌系，棉田土壤中棉花黃萎病菌數(shù)量的多少與棉花黃萎病的發(fā)生、發(fā)展及危害程度密切相關(guān)。微菌核（microsclerotia）是黃萎病的主要初侵染來(lái)源，也是大麗輪枝菌在土壤中主要的休眠結(jié)構(gòu)，其數(shù)量及存活狀態(tài)決定著黃萎病的發(fā)生嚴(yán)重程度。大麗輪枝菌的微菌核是由單根或多根分生菌絲的分隔膨大、胞壁加厚并經(jīng)過(guò)高度黑化形成典型的微菌核[4]。土壤中微菌核的數(shù)量對(duì)棉花黃萎病的動(dòng)態(tài)發(fā)生、流行、傳播起著至關(guān)重要的作用[5]，因此，定量土壤中棉花黃萎病微菌核的密度對(duì)指導(dǎo)棉花黃萎病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及防護(hù)有著重要作用。本試驗(yàn)利用選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)土壤中的棉花黃萎病菌微菌核在空間動(dòng)態(tài)分布上的特點(diǎn)以及通過(guò)棉花的不同生育期來(lái)檢測(cè)微菌核的數(shù)量變化，從而明確土壤中微菌核的季節(jié)變化情況與田間的棉花黃萎病病害發(fā)生是否具有相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

本試驗(yàn)在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站棉花黃萎病病圃中進(jìn)行，該病圃已建成18年，病圃黃萎病發(fā)病均勻一致。

1.2 土壤樣品的采集和處理

供試病田土壤樣品于2014年、2015年和2017年采集于石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)站病圃，分別采集棉花生育期的前期 （4月中旬或者播種前）、苗期 （5月中旬）、蕾期（6月中旬）、花鈴期（7月中旬）、吐絮初期（8月份）、吐絮期（9月中旬）和棉花收獲后期（10月中下旬）土壤土樣。于田間隨機(jī)取5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)在不同土層 （0～10 cm、10～20 cm、20～40 cm、40～60 cm）用取土器取土壤樣本裝入無(wú)菌密封袋中，充分混勻后作為一個(gè)分析土樣。田間帶菌土壤收集后于室溫自然風(fēng)干3周（殺死菌絲和孢子），使含水量在10%左右，用滅菌研磨缽將土壤充分混勻研磨，然后過(guò)2 mm孔徑細(xì)篩，去除植物殘?bào)w雜質(zhì)，收集通過(guò)篩孔的土樣，裝入無(wú)菌密封袋中，4℃保存待用。

1.3 土壤中微菌核的檢測(cè)

土壤微菌核定量測(cè)定采用選擇性培養(yǎng)基法，用大麗輪枝菌選擇性培養(yǎng)基（MSEA），即2 g NaNO3、1 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O、0.5 g KCl、0.01 g FeSO4·7H2O、2g多聚半乳糖醛酸、1 mL tergitol NP10（Sigma，UK）和15 g瓊脂（Fluka，UK）用蒸餾水定容至1 L，添加瓊脂前用1mol/LKOH調(diào)pH值至6.4。高壓滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻到55°C左右，添加10%體積過(guò)濾滅菌后的抗生素混合液（每10 mL含6 mg鏈霉素、6 mg氯霉素、6 mg金霉素和0.6 mg維生素H）。將病圃中采集的土壤按照不同年份、月份、不同土層（0～10 cm、10～20 cm、20～40 cm、40～60 cm） 各稱取1 g，均勻涂布在大麗輪枝菌選擇性培養(yǎng)基（MSEA）上，每個(gè)處理3次重復(fù)，放入25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d。用流水沖洗去除表面的土壤顆粒后，用倒置顯微鏡觀察整個(gè)培養(yǎng)基表面，計(jì)數(shù)平板上微菌核的數(shù)量，確定單位重量土壤中微菌核的數(shù)量。

表1 微菌核在土層中的垂直分布

表2 微菌核在土壤中的季節(jié)動(dòng)態(tài)

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA）。各處理的平均值用Duncan進(jìn)行組間差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 微菌核在土層中的垂直分布

表1結(jié)果表明，棉花黃萎病菌微菌核在棉田耕作層中垂直分布是不均勻的。微菌核主要分布在0～20 cm的土層中，20～40 cm的土層中微菌核數(shù)量相對(duì)較少，40 cm以下的土層中微菌核數(shù)量很少。檢測(cè)顯示，在10～20 cm土層中，微菌核分布最多，平均含量為21.41個(gè)/g，占總數(shù)的39.55%；0～10 cm土層中，平均含量為16.48個(gè)/g，占總數(shù)的30.44%；在20～40 cm土層中，微菌核數(shù)量逐漸減少，平均含量為11.30個(gè)/g，占總數(shù)的20.87%；在40～60 cm土層中，微菌核數(shù)量很少，平均含量為4.95個(gè)/g，占總數(shù)的9.14%。即隨著取土深度的增加，微菌核數(shù)量逐漸減少。

2.2 土壤中微菌核的季節(jié)變化動(dòng)態(tài)

棉田土壤中微菌核的動(dòng)態(tài)變化情況結(jié)果見(jiàn)表2和圖1，以10～20 cm土層的微菌核數(shù)量為例，在棉花生長(zhǎng)季節(jié)，土壤中微菌核數(shù)量與棉花的生長(zhǎng)階段具有一定相關(guān)性。在4月棉花播種期間或播種前期，棉田土壤中的微菌核數(shù)量最低，僅為2.65個(gè)/g，棉花播種出苗后到開(kāi)花期（5、6、7月）土壤中的微菌核數(shù)量快速增長(zhǎng)，分別為16.15個(gè)/g、14.57個(gè)/g和16.67個(gè)/g；棉花結(jié)鈴盛期土壤中微菌核數(shù)量達(dá)到最高峰，平均為33.00個(gè)/g；9～10月棉花吐絮和收獲期微菌核數(shù)量又明顯降低，為14.70個(gè)/g。表明土壤中棉花黃萎病菌微菌核數(shù)量隨著棉花生育期的變化而呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化，從播種前土壤中數(shù)量較少，播種到開(kāi)花前期病菌在土壤中不斷累積和增加，到結(jié)鈴盛期微菌核數(shù)量達(dá)到最高峰，棉花吐絮后病菌數(shù)量再次下降，之后進(jìn)入休眠階段。土壤中黃萎病菌微菌核的季節(jié)變化情況與田間的病害發(fā)生趨勢(shì)完全一致。

圖1 微菌核在土壤中的季節(jié)動(dòng)態(tài)

3 結(jié)論與討論

據(jù)馬存[10]報(bào)道，我國(guó)北方棉區(qū)黃萎病的發(fā)展趨勢(shì)呈現(xiàn)“馬鞍形”，即剛開(kāi)始的發(fā)病會(huì)較快，到7月下旬至8月上旬黃萎病病情發(fā)展較緩慢，隨后發(fā)展又會(huì)增快，直到病情達(dá)到高峰期后逐漸趨于穩(wěn)定，由于內(nèi)地的氣候四季分明，大多數(shù)年份棉花黃萎病會(huì)在棉花生長(zhǎng)期出現(xiàn)2個(gè)高峰，但新疆棉區(qū)屬于典型的大陸性氣候，春季時(shí)間很短，6月上、中旬發(fā)病不久就進(jìn)入夏季高溫，病情發(fā)展因?yàn)楦邷囟兴种?，所以第一個(gè)高峰不明顯或不出現(xiàn)，最終只有1個(gè)發(fā)病高峰。據(jù)賈濤等[11]報(bào)道，在土壤垂直分布中，棉花黃萎病菌主要分布于0～40 cm耕作層中，占總菌量的90%多，而40 cm以下土層中，僅占總菌量的10%。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選擇性培養(yǎng)基法對(duì)石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)站病圃棉花不同時(shí)期的不同土層土壤中的微菌核進(jìn)行了定量檢測(cè)，5月份微菌核會(huì)小幅度增長(zhǎng)1次，7月份土壤中的微菌核緩慢增長(zhǎng)，8月份土壤中的微菌核達(dá)到最大值，與馬存報(bào)道的黃萎病的流行特點(diǎn)基本一致，即7月下旬至8月上旬病情緩慢發(fā)展，8月中、下旬進(jìn)入發(fā)病高峰期。大麗輪枝菌微菌核是通過(guò)在不良環(huán)境下所產(chǎn)生抵御不良環(huán)境的休眠結(jié)構(gòu)，可以在無(wú)寄主的條件下在土壤中存活多年并且長(zhǎng)期積累[12]。棉花黃萎病是維管束系統(tǒng)性全生育期病害，防治難度較大，到目前為止，沒(méi)有特效的防治藥劑[13]。這種病原菌長(zhǎng)年存在于土壤中，簡(jiǎn)桂良[14]報(bào)道的文章表明，我們可以創(chuàng)造一個(gè)不利于病原菌生存的生態(tài)環(huán)境，利用一些具有競(jìng)爭(zhēng)作用的微生物與它進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位。

中外許多學(xué)者致力于研究微菌核數(shù)量檢測(cè)的這項(xiàng)工作，目前，對(duì)土壤中微菌核數(shù)量檢測(cè)的方法主要有選擇性培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法[15-18]、分子檢測(cè)法[19-21]等。其中，選擇性培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法應(yīng)用最為廣泛。由于微菌核在土壤中分布不均會(huì)出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，所以數(shù)據(jù)波動(dòng)比較大，檢測(cè)棉花黃萎病微菌核數(shù)量是一項(xiàng)重要的工作，并且通過(guò)大麗輪枝菌選擇性培養(yǎng)基法對(duì)土壤中的微菌核定量檢測(cè)，對(duì)黃萎病的預(yù)測(cè)及防治有著重要的作用。

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