口腔頜面部細(xì)菌感染體外模型的建立

史慶怡,孔晨飛,王曉峰*, 張?zhí)旆?

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.口腔科;2.科學(xué)研究中心，吉林 長(zhǎng)春130033)

口腔頜面部感染在早期沒(méi)有得到有效的治療，會(huì)引發(fā)頜面部感染，可并發(fā)頜面蜂窩織炎、下頜骨骨髓炎等，甚至導(dǎo)致全身性的感染，嚴(yán)重者會(huì)威脅生命[1]。急性炎癥涉及多個(gè)環(huán)節(jié)誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫介質(zhì)網(wǎng)絡(luò),其中以促炎癥因子TNF-α、IL-1 以及IL-6 等前炎癥細(xì)胞因子最為重要[2，3]。TNF-α、IL-1 和IL-6被早期應(yīng)答觸發(fā),通過(guò)上調(diào)黏附分子和趨化因子的表達(dá)而吸引炎癥細(xì)胞循環(huán),在宿主防御微生物感染中起重要作用[4]。本次實(shí)驗(yàn)中，我們利用細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞L929初步模擬了體外口腔頜面部感染模型[5]，應(yīng)用CCK-8、PCR和ELISA等方法檢測(cè)了不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中炎癥因子及趨化因子等相關(guān)基因的表達(dá)變化。并檢測(cè)了LPS刺激后小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7對(duì)感染的應(yīng)答情況，探討炎癥刺激對(duì)于機(jī)體及免疫細(xì)胞的影響，為口腔頜面部感染后的早期診斷和治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞L929、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院科學(xué)研究中心)。RPMI-1640、IMDM培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%含EDTA胰酶(美國(guó)Gibco 公司)；RNA 提取試劑Trizol (美國(guó)Invitrogen公司)；premix Taq(Roche公司)；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、LPS(Sigma公司)；IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)R&D公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

L929、RAW264.7細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的IMEM、1640培養(yǎng)液中(含10% 青霉素和鏈霉素)，37 ℃ 5% CO2。2-3天傳代1次。細(xì)胞鋪于的6孔板中,待細(xì)胞擴(kuò)增至70 %-80 %時(shí),用PBS 沖洗3 次,加入含有LPS(50 μg/ml)的IMDM(不含胎牛血清和雙抗)的培養(yǎng)液培養(yǎng),分別培養(yǎng)6、12、24小時(shí)。PBS作為對(duì)照組。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以2×103細(xì)胞/孔密度接種于96孔板中，復(fù)種2孔，37℃ 5% CO2過(guò)夜。分別加入20、30、40、50、60 μg/ml LPS，培養(yǎng)6、12、24 h后，加入CCK-8檢測(cè)450 nm處OD值。取3孔平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

采用Trizol試劑提取總RNA，以200-500 ng RNA為cDNA合成標(biāo)準(zhǔn)。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s。而后進(jìn)行QPCR定量檢測(cè)。利用基因特異引物PCR檢測(cè)不同循環(huán)RNA研究的描述的表達(dá)水平。用2(-DDCT)法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)。相關(guān)引物如下：

GAPDH,上游引物序列：5’-GTCGTACCACACGGCATTGTATGG-3’,下游引物序列：5’-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3’,

TNF,上游引物序列：5’-GCGACGTGGAACTGGCAGAAG-3’,下游引物序列：5’-GAATGAGAAGAGGCTGAGACATAGGC-3’,

IL-1,上游引物序列5’-ACGAAGACTACAGTTCTGCCATTGAC -3’,下游引物序列：5’-AGCCTCATCGTCTCATTGCTTGTC -3’,

IL-6,上游引物序列：5’-AGACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTG -3’,下游引物序列：5’-CATGTGTAATTAAGCCTCCGACTTGTG -3’,

IL-8,上游引物序列：5’-GCTGCTCAAGGCTGGTCCATG-3’,下游引物序列：5’-TGTTCCTGAATACACAGACATCGTAGC-3’,

IL-10，上游引物序列：5’-CTATGCTGCCTGCTCTTACTGACTG-3’,下游引物序列：5’-GAGTCGGTTAGCAGTATGTTGTCCAG-3’,

IL-23,上游引物序列：5’-GCACCTGCTTGACTCTGACATCTTC-3’,下游引物序列：5’-TGGCTGGAGGAGTTGGCTGAG-3’,

IL-33,上游引物序列：5’-AGACCAGGTGCTACTACGCTACTATG-3’,下游引物序列：5’-ACTCATGTTCACCATCAGCTTCTTCC-3’,

CXCL2,上游引物序列：5’-GACGGTCCGCTGCAACTGC-3’,下游引物序列：5’-GCGTCACACTCAAGCTCTGGATG-3’,

CXCL10,上游引物序列：5’-GACGGTCCGCTGCAACTGC-3’,下游引物序列：5’-CCGGATTCAGACATCTCTGCTCATC-3’,

GDF15,上游引物序列：5’-GAGAGGACTCGAACTCAGAACCAAG-3’,下游引物序列：5’-TCGGCGTCAGCAGGAGCAG-3’,

FOXO3,上游引物序列：5’-CCGTGAGCAAGCCGTGTACTG-3’,下游引物序列：5’-TATCCAGCAGGTCGTCCATGAGG-3’。

1.5 ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子水平

細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔密度接種于24孔板中，分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h，每孔加入50 μg/ml LPS刺激24 h，PBS作為對(duì)照組。提取細(xì)胞上清液(4℃ 1 500 rpm 10 min)，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6 表達(dá)水平，數(shù)據(jù)以pg/ml表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)細(xì)胞增殖的影響

為了探討不同濃度LPS在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)于細(xì)胞增殖的影響，我們通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)在6、12、24 h分別檢測(cè)了不同濃度 LPS(0-60 μg/ml)作用下L929和RAW264.7細(xì)胞增殖情況。兩種細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值如圖1所示。

A:L929 B:RAW264.7 細(xì)胞分別用0、10、20、30、40、50、60 μg/ml LPS刺激0、6、12、24 h后CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖率。**P<0.01

L929細(xì)胞在(10-40 μg/ml) LPS作用6 h時(shí)與0 h對(duì)照組相比，增殖率無(wú)顯著變化(P>0.05)；而LPS濃度大于50 μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖率逐漸下降。當(dāng)不同濃度LPS作用12 h時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線變化與6 h相似，說(shuō)明LPS在短時(shí)間作用下對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起持續(xù)抑制作用。當(dāng)LPS刺激24 h，濃度小于20 μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖率顯著上升(P<0.01)；而隨著濃度的增加(30-50 μg/ml)，細(xì)胞增殖率開(kāi)始下降；濃度到達(dá)50 μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖趨于平穩(wěn)，說(shuō)明LPS刺激能夠引起細(xì)胞增長(zhǎng)而高濃度則會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此在以后的實(shí)驗(yàn)中我們選擇50 μg/ml LPS刺激24 h來(lái)檢測(cè)小鼠L929細(xì)胞炎癥因子的變化情況(圖1A)。

RAW264.7細(xì)胞在LPS作用6 h，濃度小于10 μg/ml時(shí)，與0 h對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖率升高。而LPS濃度增加對(duì)于細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響。不同濃度LPS刺激12 h細(xì)胞生長(zhǎng)的曲線變化與6 h相似，說(shuō)明在短時(shí)間內(nèi)LPS能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)LPS刺激24 h，濃度小于50 μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖率顯著上升(P<0.01)；而大于50 μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖率有所回落，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間LPS刺激能夠引起細(xì)胞明顯增長(zhǎng)而高濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用(圖1B)。

2.2 RT-PCR檢測(cè)L929細(xì)胞炎癥因子、趨化因子及相關(guān)基因的表達(dá)變化水平

LPS(50 μg/ml)刺激24 h 檢測(cè)TNF及炎癥因子IL-1、IL-5、IL-6、IL-8、IL-33 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與0 h相比，50 μg/ml的LPS刺激細(xì)胞24 h后，促炎因子TNF、IL-1、IL-5、IL-8、IL-33 的表達(dá)分別升高9.6、10.0、5.8、3.0、4.4倍，說(shuō)明LPS刺激24 h能夠引起炎癥反應(yīng)；而IL-6,IL-23沒(méi)有發(fā)生明顯變化。反之，抗炎因子IL-10、IL-13表達(dá)均下降了0.6倍，進(jìn)一步證明炎癥的發(fā)生。見(jiàn)圖2。

50 μg/ml LPS刺激L929細(xì)胞24 h后，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)變化。相對(duì)mRNA表達(dá)倍數(shù)：50 μg/ml LPS刺激24 h相對(duì)mRNA表達(dá)量/0 μg/ml LPS刺激24 h相對(duì)mRNA表達(dá)量。

圖2L929細(xì)胞炎癥因子mRNA的表達(dá)量

此外，我們還檢測(cè)了此炎癥模型中趨化因子及相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL2和轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子GDF15 mRNA的表達(dá)分別升高5.2、6.9倍，說(shuō)明LPS引起了炎癥的發(fā)生，促進(jìn)了CXCL2和GDF15的產(chǎn)生。而在LPS作用下轉(zhuǎn)錄因子FOXO3和趨化因子CXCL10的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(圖3)。

2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的變化水平

如圖4A 所示，用50 μg/ml LPS刺激L929細(xì)胞12、24、48 h，細(xì)胞上清中炎癥因子IL-6 含量從0.75 pg/ml分別上升到13.69pg/ml(12小時(shí))、45.52 pg/ml(48小時(shí))；100 μg/ml LPS刺激下IL-6 含量從0.75 pg/ml分別上升到7.00 pg/ml(12小時(shí))、21.29 pg/ml(48小時(shí))；說(shuō)明LPS能夠引起L929細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。相同刺激時(shí)間內(nèi)50 μg/ml LPS比100 μg/ml LPS刺激細(xì)胞分泌IL-6的含量多，說(shuō)明LPS刺激L929細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)而分泌的IL-6不隨著LPS濃度的升高而增加。

50 μg/ml LPS刺激0、6、12、24、48 h，RAW264.7細(xì)胞上清中炎癥因子IL-6 含量分別為0.007、6.03、12.44、25.90、28.92 pg/ml；用100 μg/ml LPS刺激L929細(xì)胞0、6、12、24、48 h，細(xì)胞上清中炎癥因子IL-6 含量分別為0.007、4.76、10.10、10.09、16.90、18.21 pg/ml，說(shuō)明LPS刺激能夠引起巨噬細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答。與L929細(xì)胞一致，相同刺激時(shí)間內(nèi)50 μg/ml LPS比100 μg/ml LPS刺激細(xì)胞分泌IL-6的含量多(圖4B)。

50 μg/ml LPS刺激L929細(xì)胞24 h后，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞趨化因子及相關(guān)基因的表達(dá)變化。相對(duì)mRNA表達(dá)倍數(shù)：50 μg/ml LPS刺激24 h相對(duì)mRNA表達(dá)量/0 μg/ml LPS刺激24 h相對(duì)mRNA表達(dá)量。

圖3L929細(xì)胞趨化因子及相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量

A:L929 B:RAW264.7 細(xì)胞分別用0、50、100 μg/ml LPS刺激0、6、12、24、48 h后，ELISA檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子IL-6的含量變化。**P<0.01

3 討論

口腔頜面部間隙感染是最常見(jiàn)的繼發(fā)性口腔急性病癥之一。由于頜面部軟組織相互交錯(cuò)，之間存在不等量的疏松結(jié)締組織和脂肪，并且包含豐富的淋巴及血液循環(huán)與之相通[6]。因此當(dāng)發(fā)生感染時(shí)，疏松的結(jié)締組織變性液化，形成膿腫，在疏松結(jié)締組織內(nèi)相互融通可以波及鄰近間隙，進(jìn)一步形成彌散性蜂窩織炎，嚴(yán)重感染者可引起全身中毒癥狀如膿毒血癥，最后危及生命。由于疏松結(jié)締組織是感染發(fā)生的關(guān)鍵部位，其存在成纖維細(xì)胞的活化表型，并且感染的發(fā)生可以使成纖維細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量的促炎因子和趨化因子等，還能使其與中性粒細(xì)胞發(fā)生粘附作用，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生[6]，因此我們選擇了小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞L929作為口腔頜面部感染體外模型的研究對(duì)象，利用這一細(xì)胞株研究了細(xì)菌感染對(duì)于細(xì)胞炎癥因子的影響。

脂多糖是G-細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，脂多糖對(duì)宿主有毒性[7]。黃鋼等人用LPS誘導(dǎo)U937(組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞)構(gòu)建成了炎癥模型，用LPS刺激U937，收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞團(tuán)塊，采用ELISA檢測(cè)其中B7-H1的表達(dá)，從而證明了LPS建立感染模型的成立[8]。鏈球菌和金黃色葡萄球菌是在成人口腔頜面部感染中最常檢出的細(xì)菌[9]，LPS能夠識(shí)別分子在自然免疫的動(dòng)態(tài)程序中發(fā)揮的作用。正因如此，我們選擇LPS作為口腔頜面部感染模型中的治病因素[10]，由LPS誘導(dǎo)L929感染招募了巨噬細(xì)胞的聚集，使巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放某些炎癥因子，造成細(xì)菌對(duì)組織和細(xì)胞的傷害要比自身對(duì)機(jī)體的影響更嚴(yán)重。

巨噬細(xì)胞是一種免疫細(xì)胞，它們的主要功能是以固定細(xì)胞或游離細(xì)胞的形式對(duì)細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行吞噬以及消化，并激活淋巴或相應(yīng)的免疫細(xì)胞，令其對(duì)病原體作出反應(yīng)[11]。張娜等人用LPS刺激巨噬細(xì)胞，構(gòu)建感染模型證明 Foxo1 轉(zhuǎn)錄因子參與巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。RAW264.7為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞株，在炎癥細(xì)胞模型中常見(jiàn)[12]。我們研究在RAW264.7免疫細(xì)胞中可檢測(cè)到炎癥細(xì)胞因子的同時(shí)，也在L929 中檢測(cè)到相關(guān)炎癥因子，可以表明有感染和炎癥的存在。

在炎癥反應(yīng)當(dāng)中，主要致菌因素大多為細(xì)菌感染，所以在炎癥環(huán)境下，常含有大量的細(xì)菌代謝產(chǎn)物，從而細(xì)胞釋放出一些細(xì)胞炎癥因子，可以趨化中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等向受感染的組織遷移[13]，這些細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子是引起炎癥慢性化和組織損傷的重要因素。本實(shí)驗(yàn)研究中LPS可視為常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌，用LPS感染L929結(jié)締組織成纖維細(xì)胞初步模擬了體外感染模型，證實(shí)了金黃色葡萄球菌感染誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、IL-33、CXCL2、CXCL10、GEF1B、GDF15 在頜面部感染中的表達(dá)變化，為臨床上治療口腔頜面部感染提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李佳偉，蔡協(xié)藝.口腔頜面部間隙感染病原菌研究現(xiàn)狀[J].口腔頜面外科雜志，2013,23(3)：225.

[2]Hsieh SF,Chou CT,Liang WZ,et al.The Effect of Magnolol on Ca2+Homeostasis and Its Related Physiology in Human Oral Cancer Cells[J].Arch Oral Biol,2018,89:49.

[3]白 虹，謝蜀生.炎癥性細(xì)胞因子在沙眼衣原體肺感染中的表達(dá)及其與機(jī)體防御的關(guān)系[J].免疫學(xué)雜志,2004，20(4):274.

[4]Karta MR,Gavala ML,Curran CS,et al.Lps Modulates Rhinovirus-Induced Chemokine Secretion in Monocytes and Macrophages[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2014,51(1):125.

[5]曹承華，賀雅靜，高熒苒，等.LPS 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過(guò)程及作用機(jī)制[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2017,36(1);70.

[6]Kaushansky K,Lin N,Adamson JW.Interleukin 1 Stimulates Fibroblasts to Synthesize Granulocyte-Macrophage and Granulocyte Colony-Stimulating Factors.Mechanism for the Hematopoietic Response to Inflammation[J].J Clin Invest,1988,81(1):92.

[7]Ma CY,Shi GY,Shi CS,et al.Monocytic Thrombomodulin Triggers Lps- and Gram-Negative Bacteria-Induced Inflammatory Response[J].J Immunol,2012,188(12):6328.

[8]黃 鋼，姜 曼，白 云.LPS 調(diào)節(jié) U937 細(xì)胞上 B7-H1 表達(dá)的初步研究[J].免疫學(xué)雜志，2006,22(5)：480.

[9]Clayton A,Evans RA,Pettit E,et al.Cellular activation through the ligation of intercellular adhesion molecule-1[J].J Cell Sci,1998,111:443453.

[10]朱 珊，宋紹華，李學(xué)玉，等.口腔頜面部間隙感染的病原學(xué)分析及危險(xiǎn)因素研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2017,27(13);3052.

[11]徐志鵬,左國(guó)平，靳建亮.巨噬細(xì)胞異質(zhì)性及其在炎癥調(diào)控中的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2015,31(12):1711.

[12]張 娜，張紫燕，趙凌霞，等.FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)與炎癥的關(guān)系[J].系統(tǒng)醫(yī)學(xué),2016,1(9)：1.

[13]Olas K.Immunomodulatory properties of human serum immunoglobulin A:anti-inflammatory and pro-inflammatory activities in human monocytes and peripheral blood mononuclear cells[J].Clin Exp Immunol,2005,140(3):478.