響應(yīng)面法優(yōu)化異常畢赤酵母（Pichiaanomala）0732-1抑菌產(chǎn)物發(fā)酵條件

馬小莉，王曉東*

（石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 綠洲農(nóng)作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000）

異常畢赤酵母（Pichiaanomala）為子囊菌門異宗配合的酵母，單細(xì)胞，屬于非釀酒酵母，其分布十分廣泛。P.anomala的生長(zhǎng)溫度范圍在3～37℃、pH范圍為2～12，可以耐受低pH值、低水活度、高滲透壓、厭氧等極端環(huán)境[1]。基于以上原因，P.anomala以其獨(dú)有的生理特性及作為一種對(duì)人類、環(huán)境安全的拮抗微生物而廣泛應(yīng)用在生物防治中。

瓜類細(xì)菌性果斑病是發(fā)生在葫蘆科植物上的一種嚴(yán)重的檢疫性病害，是一種具有高度破壞性的種傳病害，其病原菌為瓜類果斑病菌（Acidovorax citrulli）（Aac），可以侵染多種葫蘆科作物如西瓜、甜瓜、南瓜、黃瓜等[2-4]。目前，生產(chǎn)上對(duì)該病害的防治主要采用化學(xué)防治方法。但據(jù)研究顯示，生產(chǎn)上常用的化學(xué)藥劑對(duì)細(xì)菌性果斑病的防治效果都不理想[5]。頻繁使用化學(xué)殺菌劑，不僅易使病菌產(chǎn)生抗藥性，而且影響環(huán)境安全和人體健康。然而，生物防治具有無污染、無公害、不產(chǎn)生抗藥性，長(zhǎng)效等優(yōu)點(diǎn)，因此，在農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展方面，利用P.anomala 0732-1對(duì)病害進(jìn)行生物防治具有重要意義。WANGX D等[6]研究發(fā)現(xiàn)，P.anomala 0732-1對(duì)哈密瓜細(xì)菌性果斑病具有良好生防效果，并發(fā)現(xiàn)該菌株能產(chǎn)生對(duì)病原具有抗生作用的有機(jī)酸類物質(zhì)。據(jù)陳好娟[7]研究發(fā)現(xiàn)，通過不同檢測(cè)方法明確P.anomala 0732-1上清液中抑菌物質(zhì)的主要組分有：乙酸、丙酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸。乙酸含量最高，其次為琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸，丙酸含量最少。

目前，有關(guān)P.anomala0732-1發(fā)酵條件及抑菌效果的研究尚處起步階段，國內(nèi)外暫無相關(guān)研究結(jié)果。在課題組前期完成了培養(yǎng)基優(yōu)化和單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)對(duì)P.anomala 0732-1抑菌產(chǎn)物發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行抑菌效果測(cè)定，以期為后期規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)及其實(shí)踐應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

異常畢赤酵母（Pichia anomala）0732-1和瓜類果斑病菌（Acidovorax citrulli）XJ05-1（Aac）由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保系王曉東提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、金氏培養(yǎng)基B（King's B agar，KBA）：參照文獻(xiàn)[8]制備；優(yōu)化培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[7]制備。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600紫外可見分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZWY-211B型恒溫振動(dòng)搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；MLS-3750型高壓滅菌器：日本三洋公司；FE20型pH計(jì)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；5417R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；SW-CJ-1C型超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；XB.K.25型紐鮑爾血球計(jì)數(shù)板：上海市求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化制備

異常畢赤酵母（P.anomala）0732-1活化：用接種環(huán)挑取試管中保存的酵母菌株劃線（接種方式）于PDA平板上，經(jīng)28℃活化36 h。用無菌水清洗菌苔，洗液裝入2 mL離心管，4℃、10 000 r/min離心5 min，重復(fù)2次，借助紐鮑爾血球計(jì)數(shù)板配制濃度為1×108CFU/mL的酵母懸浮液，備用。

瓜類果斑病菌（A.citrulli）XJ05-1（Aac）活化：Aac在KBA平板上于28℃活化48 h，用無菌水清洗菌苔，菌液裝入2 mL離心管，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，重復(fù)2次，用無菌水懸浮菌體，借助紫外-可見分光光度計(jì)將菌懸液的濃度調(diào)整到1×108CFU/mL（OD600nm值=0.3～0.4），備用。

1.3.2 抗菌物質(zhì)抑菌效果的測(cè)定

P.anomala0732-1所產(chǎn)生短鏈有機(jī)酸是其生防機(jī)制的關(guān)鍵因子，采用瓊脂孔擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈直徑[9]。吸取1 mL濃度為1×108CFU/mL（OD600nm=0.3～0.4）的Aac菌懸液加入KBA平板，使Aac菌懸液布滿全皿，吸出多余菌液，無菌條件下，晾干培養(yǎng)基表面的水分。用直徑為7 mm無菌打孔器打孔，吸取100μL樣品注入孔中，將培養(yǎng)皿置于28℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈的直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)

Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)廣泛用于因素主效應(yīng)的估計(jì)[10]，是一種近飽和的二水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，能以最少試驗(yàn)次數(shù)快速篩選出對(duì)應(yīng)變量影響顯著的幾個(gè)因素，以供進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)選取5個(gè)影響因素作為研究對(duì)象，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)表選用5因素，N=12次的試驗(yàn)表格，每組試驗(yàn)做3個(gè)平行，取平均值。分析試驗(yàn)結(jié)果，比較各因素對(duì)酵母菌抑菌效果的影響。具體試驗(yàn)因素和水平參見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在響應(yīng)面設(shè)計(jì)中，為建立有效的響應(yīng)面擬合方程，使所選各個(gè)因素的水平必須逼近最大抑菌區(qū)域，因此，必須進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)[11]。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果中各個(gè)顯著影響因素效應(yīng)的大小來設(shè)定步長(zhǎng)及變化方向，找出峰值，快速逼近最佳值區(qū)域。

1.3.5 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過最陡爬坡試驗(yàn)逼近最佳范圍后，采用響應(yīng)面分析法中Box-Behnken設(shè)計(jì)（Box-Behnken Design，BBD）法[12-13]，對(duì)其關(guān)鍵因子進(jìn)行深入研究。根據(jù)爬坡試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)主要影響因素進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB試驗(yàn)篩選主要影響因子

在前期試驗(yàn)室相關(guān)研究成果的基礎(chǔ)上，選用試驗(yàn)次數(shù)N=12的PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)液初始pH值、接種量、溫度、培養(yǎng)時(shí)間和裝樣量（150 mL三角瓶）5個(gè)因素進(jìn)行考察，表1中X1、X2、X4、X5、X7分別代表培養(yǎng)液初始pH值、接種量（%）、溫度（℃）、培養(yǎng)時(shí)間（h）和裝樣量（mL/mL），并設(shè)X3、X6、X8三個(gè)空白作為誤差分析項(xiàng)。每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平，高水平為低水平的1.5倍，每組試驗(yàn)設(shè)計(jì)3次重復(fù)來測(cè)定抑菌圈直徑。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值及結(jié)果見表2。運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行分析，選出顯著因素進(jìn)行進(jìn)一步分析。

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)PB試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，對(duì)抑菌效果有顯著影響的因素包括培養(yǎng)液初始pH值、溫度、裝樣量，因此，選取這3個(gè)因素作為顯著影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。其中培養(yǎng)液初始pH值和裝樣量具有正效應(yīng)，溫度具有負(fù)效應(yīng)。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及主效應(yīng)分析Table 3 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design and main effects analysis

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

爬坡試驗(yàn)的目的在于選出最佳水解度范圍作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]。根據(jù)表3各因素對(duì)酵母菌抑菌效果影響從大到小為：培養(yǎng)液初始pH值＞裝樣量＞培養(yǎng)溫度。由于培養(yǎng)液初始pH值和裝樣量具有正效應(yīng)，培養(yǎng)溫度具有負(fù)效應(yīng)，可以確定爬坡方向并選擇合理步長(zhǎng)（培養(yǎng)液初始pH值正向增加0.5，裝樣量正向增加5 mL，溫度減少0.5℃），每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表4所示。由表4可知，抑菌圈最大響應(yīng)值在第3組與第5組試驗(yàn)之間，因此，以第4組試驗(yàn)條件為后續(xù)試驗(yàn)中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiments

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)爬坡試驗(yàn)得出Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)，選擇3因素3水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[15-16]，對(duì)培養(yǎng)液初始pH（A）、培養(yǎng)溫度（B）、裝樣量（C）進(jìn)行研究，以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，分別以-1、0、1編碼，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表5，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平Table 5 Factors and levels of response surface experiments

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件響應(yīng)面分析程序?qū)?5組試驗(yàn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，經(jīng)過回歸方程擬合，得到各個(gè)試驗(yàn)因子的回歸方程為：

回歸方程的方差分析結(jié)果見表7。由表7可知，P＜0.01，失擬項(xiàng)P值＞F值＞0.05，說明回歸模型顯著極顯著，失擬檢驗(yàn)不顯著（P＞0.05），即該模型在所研究區(qū)域內(nèi)擬合性較好。回歸方程的決定系數(shù)R2=0.952 1，表明實(shí)際試驗(yàn)與預(yù)測(cè)值具有高度相關(guān)性，該模型可信度高，可以對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌效果進(jìn)行預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)A影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），B、C影響不顯著（P＞0.05）；交互項(xiàng)AB影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），AC、BC影響不顯著（P＞0.05）；二次項(xiàng)A2、C2影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），B2影響顯著（P＜0.05）。表明各因素對(duì)抗菌效果影響的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表7 回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

2.4 響應(yīng)曲面分析

培養(yǎng)液初始pH與溫度交互作用對(duì)抑菌圈直徑影響的響應(yīng)面及等高線圖見圖1。由圖1可知，隨著溫度和培養(yǎng)液初始pH不斷增大，抑菌圈直徑先上升后下降，說明這兩者過大或過小都不能使抑菌圈直徑達(dá)到最大值，只有當(dāng)它們?nèi)∧硞€(gè)適中值時(shí)，抑菌圈直徑才可達(dá)到最大值。通過軟件進(jìn)一步分析計(jì)算，預(yù)測(cè)最大抑菌圈直徑為18.4 mm，此時(shí)培養(yǎng)液pH為9.44，培養(yǎng)溫度為25℃，裝樣量為61.06 mL/150 mL。

圖1 培養(yǎng)液初始pH值和培養(yǎng)溫度交互作用對(duì)抑菌圈直徑影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH value of culture medium and culture temperature on the inhibition zone diameter

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design Expert8.0.6軟件得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為培養(yǎng)液初始pH 9.44、培養(yǎng)溫度25℃、裝樣量61.06 mL/150 mL。為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性和有效性，對(duì)預(yù)測(cè)的最佳發(fā)酵條件和初始發(fā)酵條件分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3次，結(jié)果取平均值。為方便實(shí)際操作修改條件為培養(yǎng)液初始pH 9.4、培養(yǎng)溫度25℃、裝樣量61 mL/150 mL、接種量8%、培養(yǎng)時(shí)間60 h?；貧w方程所得出的最高產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值18.4 mm與驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值17.9mm接近，抑菌圈直徑比優(yōu)化前（13.5mm）提高了32.6%。

3 結(jié)論

在試驗(yàn)室前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以異常畢赤酵母（Pichia anomala）0732-1為試材試，利用響應(yīng)面法優(yōu)化異常畢赤酵母0732-1抑菌產(chǎn)物發(fā)酵條件，得到最佳發(fā)酵條件：培養(yǎng)液初始pH 9.4、培養(yǎng)溫度25℃、裝樣量61 mL/150 mL、接種量8%、培養(yǎng)時(shí)間60 h。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)得到最大抑菌圈直徑17.9 mm，較優(yōu)化前抑菌效果提高32.6%，為后續(xù)酵母菌的生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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