一株殺線蟲活性海洋真菌BH-0531的培養(yǎng)特性及種屬鑒定

李 娜，張金源，苗利華，馮 欣，2，孟慶恒，2*，孫建華，2

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

菌株BH-0531是一株以松材線蟲為靶標(biāo)，從渤海灣底（E：117°53′23.2″；N：38°55′51″）水中分離得到的具有殺線蟲活性的海洋絲狀真菌。該菌株的代謝產(chǎn)物不僅具有良好的殺線蟲作用[1]，還對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌等具有明顯的抑菌活性，顯示出廣譜的抑菌作用[2]。進一步的研究表明，其代謝產(chǎn)物可明顯影響土壤中的微生物類群和數(shù)量，對土壤的去真菌化作用顯著，有利于植物真菌病害的防治[3]，顯示出良好的開發(fā)潛力，因此，有必要進一步明確其培養(yǎng)特性和分類地位。

前期的鑒定結(jié)果顯示，菌株BH-0531具有枝頂孢屬（Acremonium）的屬性。枝頂孢屬舊稱頭孢霉屬（Cephalosporium），因生物合成頭孢菌素而具有十分重要的地位[4]。該屬是一個無性型的屬，有超過150個種，目前國內(nèi)已明確的種僅有13個[5]。其次生代謝產(chǎn)物種類豐富，如環(huán)肽、蒽醌類、酚類等，均具有良好的生物活性[6]。這也使得菌株BH-0531的種性研究顯得更有必要。據(jù)此，本實驗以菌株BH-0531為研究對象，對其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長特性等生物學(xué)特性進行了觀察分析，并借助Biolog微生物鑒定系統(tǒng)，以及5.8SrDNA-ITS序列分析對菌株進行了分類鑒定，旨在為該菌株的進一步研究和應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

海洋真菌BH-0531（菌種保藏號CGMCC-5445）：天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，無水硫酸鎂0.5 g，瓊脂20 g，補蒸餾水至1000mL。

查氏瓊脂培養(yǎng)基：查氏瓊脂培養(yǎng)基47 g，1 000 mL蒸餾水，煮沸溶解。

海水瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，葡萄糖10 g，酵母膏1 g，海水600 mL，補蒸餾水至1 000 mL。

20%麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：Oxoid麥芽抽提物20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，煮沸溶解，冷卻后調(diào)整pH值至5.5±0.2（25 ℃）。

玉米粉瓊脂培養(yǎng)基：玉米粉30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，玉米粉文火煮沸后計時1 h，4層紗布過濾。

上述培養(yǎng)基均121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖（分析純）：天津市鳳傳化學(xué)試劑有限公司；瓊脂（分析純）：天津市珠海衛(wèi)生材料廠；硫酸鎂（分析純）：西安化學(xué)試劑廠；蛋白胨、酵母膏、查氏瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化銨、硝酸鈉（均為分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；FF-IF接種液、Oxoid麥芽抽提物（均為生物試劑）：天津福寶德科技發(fā)展有限公司；乳酸酚棉藍染液（生物試劑）：天津為科生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YXQG02型電熱式滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械廠；LEICA DME（MVC2000）顯微鏡、LEICA DM6000顯微鏡：上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；Biolog微生物鑒定系統(tǒng)（GENIIIMicrostation）：美國Biolog公司。Catalog No.3532-220 volt model濁度儀：天津福寶德科技發(fā)展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 供試菌種的活化

將保存的菌種BH-0531接種于PDA培養(yǎng)基斜面試管中，26℃培養(yǎng)7 d。

1.3.2 海洋真菌BH-0531的生物學(xué)特性觀察

（1）菌落培養(yǎng)特性觀察

將活化好的菌種用打孔器在菌落邊緣切取直徑6 mm的菌絲塊分別接種于不同培養(yǎng)基平板中央，26℃培養(yǎng)7 d，十字交叉法測量菌落直徑，觀察并記錄初生菌絲顏色、菌落顏色變化、表面特征、產(chǎn)色素情況等，菌株培養(yǎng)條件見表1。

表1 菌株BH-0531的培養(yǎng)條件Table 1 Culture conditions of strain BH-0531

（2）菌絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的顯微觀察

采用小室培養(yǎng)法[7]。26℃小室培養(yǎng)6 d后，用乳酸酚棉藍染液染色，顯微鏡下觀察菌絲、孢子和產(chǎn)孢器結(jié)構(gòu)特征。

1.3.3 Biolog微生物鑒定系統(tǒng)分析

將已活化兩代的菌種接種于20%麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)7 d，挑取孢子于FF-IF接種液中，利用濁度儀配制成孢子濃度為（75±2）%的菌懸液，將菌懸液按每孔100μL的接種量添加到FF鑒定板上，鑒定板置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在24 h、48 h、72 h、96 h、168 h分別用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)讀取結(jié)果，獲得菌株BH-0531對96種碳源的利用情況，對結(jié)果進行分析。

1.3.4 序列比對分析

采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）分別作為上下游引物擴增ITS序列，菌種樣品送至北京華大基因科技股份有限公司進行測序（www.genomics.cn），序列提交到Genbank進行Blast對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件下菌株BH-0531的培養(yǎng)及生長特性

2.1.1 菌株BH-0531在不同海水含量中的生長情況

圖1 菌株BH-0531在不同海水含量中的菌落直徑Fig.1 Colony diameter of strain BH-0531 in different seawater concentrations

由圖1可知，菌株BH-0531在0～60%海水含量范圍內(nèi)的培養(yǎng)基中均能生長，且隨著培養(yǎng)基海水含量的增加，菌落直徑先增加后減小，在20%海水含量的培養(yǎng)基中的菌落直徑最大，為4.73 cm，與其他海水含量培養(yǎng)基的菌落直徑差異顯著（P＜0.05），因此，菌株BH-0531生長的最適海水含量為20%。

2.1.2 菌株BH-0531在不同培養(yǎng)基中的生長情況

圖2 菌株BH-0531在不同培養(yǎng)基中的菌落直徑Fig.2 Colony diameter of strain BH-0531 in different media

由圖2可知，菌株BH-0531在各培養(yǎng)基中均能正常生長，培養(yǎng)7 d后，PDA培養(yǎng)基、查氏瓊脂培養(yǎng)基和20%海水瓊脂培養(yǎng)基中的菌落直徑分別為4.12cm、3.43cm、4.73cm，菌落直徑差異顯著（P＜0.05）。因此，20%海水瓊脂培養(yǎng)基更適合該菌株生長。

2.1.3 菌株BH-0531在不同氮源中的生長情況

圖3 菌株BH-0531在不同氮源中的菌落直徑Fig.3 Colony diameter of strain BH-0531 in different nitrogen sources

由圖3可知，菌株BH-0531在不同氮源培養(yǎng)基的菌落直徑差異顯著（P＜0.05），其中菌株對硝酸鈉的利用最好，菌落直徑最大，優(yōu)于其他氮源（酵母膏、氯化銨、蛋白胨）。因此，菌株BH-0531的最適氮源為硝酸鈉。

2.1.4 菌株BH-0531在不同pH條件下的生長情況

圖4 菌株BH-0531在不同pH下的菌落直徑Fig.4 Colony diameter of strain BH-0531 under different pH

由圖4可知，菌株BH-0531在pH 4～9的范圍內(nèi)均能良好生長。當(dāng)pH值為6時，菌落直徑最大，與pH值為7時的菌落直徑無顯著性差異（P＞0.05），而兩者與其他pH條件下的菌落直徑有顯著性差異（P＜0.05），因此，菌株BH-0531的最適pH值為6～7。

2.1.5 菌株BH-0531在不同溫度條件下的生長情況

由圖5可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株菌落直徑呈先增加后減小的趨勢，適合菌株BH-0531生長的溫度為22～28℃，且溫度為26℃時，菌落直徑最大，與其他溫度條件下的菌落直徑差異性顯著（P＜0.05），表明該菌株的最適溫度為26℃。

圖5 菌株BH-0531在不同溫度中的菌落直徑Fig.5 Colony diameter of strain BH-0531 in different temperatures

2.2 菌株BH-0531的Biolog鑒定及碳源譜分析

FF鑒定板共有96種碳源，結(jié)果顯示，菌株BH-0531可利用的碳源為76種。值得注意的是，在4種胺類碳源中，菌株BH-0531僅能利用腐胺，其他不能被利用，表明該菌株具有一定的腐生特性。由于Biolog微生物鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中無對應(yīng)菌種，因此不能據(jù)此得出明確的菌種鑒定結(jié)果。

2.3 菌株BH-0531的形態(tài)特征觀察結(jié)果

將菌株BH-0531在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上26℃培養(yǎng)14 d后，觀察菌株形態(tài)，結(jié)果見圖6。

圖6 菌株BH-0531的形態(tài)學(xué)特征Fig.6 Morphological characteristics of strain BH-0531

由圖6可知，菌株BH-0531在7 d直徑達到4.1～4.2 cm，14 d直徑為6.9～7.0 cm。菌落有局限，較平坦，質(zhì)地絨氈狀，初生菌絲體白色，隨培養(yǎng)時間延長，顏色變?yōu)榉凵滟|(zhì)地變?yōu)榉圪|(zhì)狀，稍濕，邊緣整齊不一，菌落背面呈淡橘黃色（見圖6A、圖6B）。顯微觀察結(jié)果顯示，菌絲有隔，分枝明顯，氣生菌絲直徑1.5～2.0μm，營養(yǎng)菌絲直徑1.0～1.5μm，常形成不編結(jié)繩狀菌絲束，分生孢子梗自菌絲垂直生出，逐漸變細，無隔、無分枝，與菌絲間有隔，直立，單生，長度為20～30μm，分生孢子頂生，可形成黏性孢子頭，孢子無色，近圓形、橢圓形，頂端有尖，大小（2.5～2.7）μm×（5.0～7.0）μm，壁光滑，未見厚垣孢子（見圖6C、圖6D）。繁殖方式為分生孢子萌發(fā)生成菌絲（見圖6E）。上述特征與已有的枝頂孢霉屬（Acremonium）[8-9]的特征描述具有一致性。

進一步的觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株在玉米粉瓊脂（產(chǎn)孢）培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，可見菌絲間的接合，并觀察到由菌絲形成的長形子囊，內(nèi)含4～8個子囊孢子。子囊孢子多為長橢圓形，一端有尖，表面相對光滑，大小為（7.5～12.5）μm×（2.5～5.0）μm，近無色。子囊孢子在子囊內(nèi)間隔排布，間距2.5～5μm不等（圖6F）。實驗條件下未見子囊殼形成。

2.4 ITS序列比對分析

將測得的序列經(jīng)BLAST進行序列相似性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖7。

圖7 菌株BH-0531基于5.8S rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain BH-0531 based on 5.8S rDNAITS sequence

由圖7可知，菌株BH-0531序列與Acremonium potronii isolate35同源性達到了100%，借助MEGA6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后，發(fā)現(xiàn)菌株BH-0531與Acremonium potronii isolate 35在同一分支，且其與Acremonium potronii isolate 194、Acremoniumpotronii isolate30、Acremonium potronii isolate MS02同源性為99%。菌株BH-0531種屬地位明確指向波氏枝頂孢霉（Acremonium potronii）。

枝頂孢屬是一個依據(jù)菌株無性階段所顯現(xiàn)的屬性和親緣關(guān)系而劃分的無性型屬[10]，按照GAMESW等[11-12]的體系可劃分為3組，其有性階段多指向翅孢殼屬（Emericellopsis）[13]。研究結(jié)果顯示，該菌株雖然在產(chǎn)孢培養(yǎng)基條件下可觀察到子囊和子囊孢子，但未觀察到子囊殼的形成，其子囊殼的類型未知，因而將其劃歸翅孢殼屬（Emericellopsis sp.）的依據(jù)不足。相對而言，依據(jù)無性階段的顯微結(jié)構(gòu)和菌落培養(yǎng)特征，特別是依據(jù)ITS序列進行的BLAST對比結(jié)果，將其劃歸枝頂孢屬（Acremonium sp.）的證據(jù)顯得更加充分，并將該菌種的種屬地位指向波氏枝頂孢霉（A.potronii）。

菌株BH-0531分離自渤海灣底水，培養(yǎng)特性顯示，該菌株可在較高濃度的海水條件下正常生長，能以海水中富含的硝態(tài)氮為良好氮源，并可利用腐胺，這與已記錄的A.potronii菌株（多為內(nèi)生菌或病原菌）存在著營養(yǎng)特性和來源上的區(qū)別[14-15]。此外，對比還發(fā)現(xiàn)，菌株BH-0531在菌落特征、孢子形態(tài)和大小等方面也都存在著一定的差異[5]。據(jù)此，鑒定菌株BH-0531為A.potronii的海棲型變種：Acremonium potronii var.marine BH-0531。

3 結(jié)論

本研究以海洋絲狀真菌BH-0531為研究對象，通過設(shè)置不同的培養(yǎng)基、海水濃度、氮源、pH、溫度等培養(yǎng)條件對該菌株的培養(yǎng)特性進行了研究，并在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，通過5.8SrDNA-ITS序列對比及Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)對該菌株進行了菌種鑒定。研究結(jié)果表明，菌株BH-0531最適海水含量為20%，最適培養(yǎng)條件為20%海水瓊脂培養(yǎng)基，溫度26℃，pH6～7，氮源為硝酸鈉；ITS序列分析結(jié)果表明，菌株BH-0531序列與Acremonium potronii isolate35同源性達到了100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察，鑒定該菌株為A.potronii的海棲型變種：Acremonium potronii var.marine BH-0531，為進一步開發(fā)該菌株奠定了種屬基礎(chǔ)，并為其發(fā)酵培養(yǎng)條件的進一步優(yōu)化提供了一定的生物學(xué)培養(yǎng)特性的理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]MENGQ H,SHIX X.Isolation of an Acremonium sp.from a screening of 52 seawater fungal isolates and preliminary characterization of its growth conditionsand nematicidal activity[J].Biotechnol Lett,2012,34(10)：1847-1850.

[2]孟凡歡，王勇勇，蒙春蕾.渤海灣絲狀海洋真菌抑菌活性菌株的調(diào)查研究[J].天津師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2014，34（4）：64-67.

[3]黃 敏，劉曉霞，申佩娟.海洋枝頂孢霉BH0531對黃瓜根結(jié)線蟲防治的微生態(tài)效應(yīng)[J].中國釀造，2016，35（3）：52-56.

[4]JOSEPG,JOSEPA G,ALBERTOM S.Developments in reviews fungal taxonomy[J].Clin Microbiol,1999,12(3)：454-500.

[5]WANG Y Z,GUO F,ZHOU Y G.Survey of Acremonium species from Chinawith threenew records[J].菌物學(xué)報，2002，21（2）：192-195.

[6]姚 磊，徐良雄，薛璟花.枝頂孢屬真菌的抑菌活性及其代謝產(chǎn)物研究[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2012，20（2）：192-196.

[7]沈 萍，陳向東.微生物學(xué)實驗[M].北京：高等教育出版社，2007：74.

[8]DASS,SAHA R,DAR SA.Acremonium species：A review of the etiological agentsof emerging hyalohyphomycosis[J].Mycopathologia,2010,170(6)：361-375.

[9]裘維蕃.菌物學(xué)大全[M].北京：科學(xué)出版社，1998：890.

[10]PERDOMOH,SUTTON D A,GARCIA D.Spectrum of clinically relevant Acremonium speciesin the United States[J].J Clin Microbiol,2011,49(1)：243-256.

[11]GAMESW.Cephalosporium-artige Schimmelpilze(Hyphomycetes)[M].Stuttgart：Gustav Fischer Verlag,1971：253-258.

[12]GAMESW.Cephalosporium-like Hyphomycetes：some tropical species[J].Trans Brit Mycol Soc,1975,64(3)：389-404.

[13]中國科學(xué)院微生物研究所.常見與常用真菌[M].北京：科學(xué)出版社，1973：210-215.

[14]FORSTER R K,REBELL G,STILES W.Recurrent keratitis due to Acremonium potronii[J].Am J Ophthalmol,1975,79(1)：126-128.

[15]ALEJANDRA G,JOSEPA G,JOSEPC.Twonew speciesof Acremonium from Spanish soils[J].Mycologia,2012,104(6)：1456-1465.