替加環(huán)素對(duì)復(fù)雜性腹腔感染患者免疫功能影響

郭茂松，余維麗，孫 昀

復(fù)雜性腹腔感染(complicated intra-abdominal infections，cIAI) 是腹腔內(nèi)臟器穿孔或破裂，導(dǎo)致感染源侵入腔內(nèi)，形成膿腫或腹膜炎的一類疾病[1]。cIAI多數(shù)情況為混合細(xì)菌感染，感染源包括革蘭陰性厭氧菌、有氧桿菌、陽(yáng)性有氧和厭氧球菌等，需廣譜抗生素或多種抗生素聯(lián)合[1-2]。替加環(huán)素是首個(gè)甘氨酰四環(huán)素類抗生素，有廣譜抗菌活性，治療cIAI療效肯定，是臨床一線藥物[3]。替加環(huán)素可降低cIAI患者外周血IgA水平、升高IgM和IgG水平[4]。此外，替加環(huán)素可降低脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激下大鼠神經(jīng)元細(xì)胞炎性細(xì)胞因子和介質(zhì)的釋放，提示替加環(huán)素具有免疫調(diào)控作用[5]。該研究進(jìn)一步探討替加環(huán)素體內(nèi)外對(duì)cIAI患者免疫功能的影響，為深入研究替加環(huán)素抗感染藥理作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病例資料2015年6月～2017年6月，安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院ICU科室共收治24 例cIAI患者，其中男17 例，女7 例，年齡27～68歲(51.92±9.17) 歲，原發(fā)性疾病種類及病例數(shù)如下：上消化道穿孔8 例，胃腸道手術(shù)后吻合口漏5例，闌尾膿腫3 例，急性闌尾穿孔4 例，化膿性膽囊炎2 例，肝膿腫2 例。所收患者因感染性休克或血液動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定入住重癥醫(yī)學(xué)科。此外，15 例健康志愿者男11 例，女4 例，年齡23～76歲(50.64±9.49)歲。相關(guān)標(biāo)本來(lái)自同期安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢中心，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，兩組患者年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2cIAI診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]具有cIAI手術(shù)指征(剖腹手術(shù)、腹腔鏡手術(shù)或經(jīng)皮引流膿腫手術(shù))，二次手術(shù)或影像學(xué)證明具有至少一項(xiàng)以上診斷：膽囊炎伴有破裂或穿孔、憩室性疾病伴有穿孔和膿腫、闌尾穿孔或圍闌尾膿腫、急性胃或十二指腸穿孔、腸外傷性穿孔、內(nèi)臟穿孔引起的腹膜炎、手術(shù)后腹膜炎、腹腔膿腫等。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：腹壁膿瘍、小腸梗阻、女性生殖道感染、納入研究前72 h內(nèi)接受其他系統(tǒng)抗生素治療、患者伴有血細(xì)胞低比容水平(<25%),血小板計(jì)數(shù)低于75 000/mm3或中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于1 000/mm3以及其他危及生命疾病(急性肝衰竭和肝疾病)，因腹腔感染具有替加環(huán)素、舒普深、替考拉寧、泰能等使用史的患者。

1.3治療方案和療效評(píng)價(jià)當(dāng)前研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬均知情同意后執(zhí)行。cIAI患者治療方案如下，替加環(huán)素(輝瑞制藥公司泰格，批號(hào)：H20143394)首次治療劑量100 mg, 維持劑量 50 mg/每12 h，靜脈滴注，治療時(shí)間7～14 d，采用經(jīng)驗(yàn)性治療有效后根據(jù)微生物培養(yǎng)結(jié)果，抗生素采用降階梯和序貫治療，如標(biāo)本中分離出真菌或者其它非替加環(huán)素抗菌譜覆蓋的病原微生物(如銅綠假單胞菌)，則根據(jù)藥敏結(jié)果加用相應(yīng)敏感抗菌藥物，尋找腹部感染灶并行積極沖洗引流等措施，但該部分?jǐn)?shù)據(jù)不納入最終統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。根據(jù)《抗菌藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[6]，考察患者臨床癥狀消失, 實(shí)驗(yàn)室檢查及細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果；上述結(jié)果均為陰性為顯著性有效；治療后患者臨床癥狀、體征基本消失或者顯著改善，且實(shí)驗(yàn)室檢查及細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果部分改善記為有效；治療前后患者臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查及細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果無(wú)明顯變化為無(wú)效。VITEK-2型全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃生物公司)對(duì)腹腔感染標(biāo)本分離的病原體進(jìn)行鑒定。

1.4外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)制備及增殖水平[7]在替加環(huán)素干預(yù)前及干預(yù)后采用梯度離心法制備cIAI患者和健康志愿者PBMC。清晨空腹取外周血3 ml，肝素抗凝，以磷酸鹽緩沖鹽(PBS)等體積稀釋，F(xiàn)icoll進(jìn)行密度梯度離心(1 800 r/min，20 min)后，吸取白絮狀單核細(xì)胞層，PBS洗滌，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×109/L。將上述細(xì)胞按照1×105個(gè)/每孔接種于96孔板中，每孔終體積 200 μl。實(shí)驗(yàn)分組如下：正常組、模型組、1 mg/L、2 mg/L和5 mg/L替加環(huán)素(阿拉丁試劑公司，純度>96%)組, 其中，除正常組外，各組均用100 μg/L金黃色葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxins A, SEA, 美國(guó)毒素科技公司) 刺激24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h，加入100 μl MTT溶液(5 g/L) 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng), 采用酶標(biāo)儀 (美國(guó)BioTek公司) 檢測(cè)各孔吸光度(absorbance，A)值 (A570 nm)。

1.5細(xì)胞因子水平取健康志愿者、治療前以及治療后cIAI患者外周血3 ml，分離血清。同前法制備PBMC細(xì)胞。白細(xì)胞介素-1(interleukin-1 , IL-1)、IL-6和IL-8的水平檢測(cè)參照酶聯(lián)免疫試劑盒(美國(guó)RD Systems公司)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.6PBMCT亞群細(xì)胞分別在治療前和治療后抽取健康志愿者、治療前以及治療后的cIAI患者外周血2 ml，加入抗凝劑EDTA。取100 μl抗凝血加入流式管，加入熒光標(biāo)記的抗體10 μl 染色混勻，包括 CD3+、CD4+、CD8+抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。室溫避光孵育30 min，加入溶血素500 μl裂解紅細(xì)胞，室溫避光孵育 20 min 上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(FC500，美國(guó)Beckman Coulter 公司)。

2 結(jié)果

2.1替加環(huán)素有效抑制cIAI患者腹腔感染替加環(huán)素對(duì)cIAI患者總有效率為70.8%(顯效率45.80%+有效率25.0%)，無(wú)效率為29.2%。此外，24例患者共分離出大腸桿菌17株、陰溝腸桿菌7 株、鮑氏不動(dòng)桿菌9 株、梭狀芽孢桿菌8株、消化鏈球菌11株、腸球菌9株、金黃色葡萄球菌10株、咽峽炎鏈球菌11株、奇異變形菌9株、肺炎克雷伯菌6株。替加環(huán)素對(duì)病原微生物抑制率依次為70.6%(大腸桿菌)、42.9%(陰溝腸桿菌)、55.6% (鮑氏不動(dòng)桿菌)、75.0%(梭狀芽孢桿菌)、72.7%(消化鏈球菌)、77.8%(腸球菌)、60.0%(金黃色葡萄球菌)、72.7%(咽峽炎鏈球菌)、55.6%(奇異變形菌)、83.3%(肺炎克雷伯菌)。

2.2替加環(huán)素降低cIAI患者血清和PBMC炎性細(xì)胞因子的水平與正常組比較，cIAI患者治療前的血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IL-8含量水平明顯較高(t=-3.119、-5.964、-6.723,P<0.01)；與治療前相比較，cIAI患者治療后IL-1β、IL-6和IL-8含量水平顯著降低(t=4.734、5.552、7.968，P<0.01)。此外，體外制備PBMC細(xì)胞，采用SEA刺激可顯著提高細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6和IL-8的水平(P<0.01)，替加環(huán)素體外給藥能夠顯著降低PBMC上清液中IL-1β、IL-6和IL-8的含量水平(P<0.01)，提示替加環(huán)素直接降低炎性細(xì)胞因子水平。見(jiàn)圖1、2。

2.3替加環(huán)素降低cIAI患者PBMC增殖水平與正常組PBMC比較，SEA體外刺激能夠明顯增加PBMC的增殖水平(P<0.01)。替加環(huán)素體外給藥能顯著降低SEA刺激下PBMC的增殖水平(P<0.01)，結(jié)果提示替加環(huán)素對(duì)SEA激活的PBMC增殖反應(yīng)具有直接的抑制作用。見(jiàn)圖3。

2.4替加環(huán)素調(diào)節(jié)cIAI患者外周血CD3,CD4和CD8的表達(dá)水平與正常組比較，cIAI患者治療前外周血CD3+、CD4+百分比明顯降低，CD4+/ CD8+比值明顯降低，CD8+百分比明顯升高(P<0.01)；與cIAI患者治療前比較，替加環(huán)素治療后可顯著提高外周血CD3+、CD4+百分比和CD4+/CD8+比值，并同時(shí)降低CD8+百分比(P<0.01)，提示替加環(huán)素對(duì)cIAI患者的體內(nèi)免疫失衡存在一定的調(diào)節(jié)作用。見(jiàn)表1。

圖1 替加環(huán)素降低cIAI患者血清炎性細(xì)胞因子的水平

圖2 替加環(huán)素降低cIAI患者PBMC上清液炎性細(xì)胞因子的水平

項(xiàng)目正常組(n=15)替加環(huán)素(n=17)治療前治療后t1值t2值CD3+(%)70．24±6．3360．17±5．59#68．92±5．08??2．230-4．269CD4+(%)38．02±4．2730．72±4．67##36．69±5．05??2．252-5．254CD8+(%)23．55±3．7129．02±3．66##24．11±4．08?-3．6043．328CD4+/CD8+1．54±0．321．03±0．29##1．49±0．34??2．257-6．783

與正常組比較：#P<0.05,##P<0.01；與替加環(huán)素治療前比較：*P<0.05,**P<0.01；t1:治療前與正常組比較；t2:治療后與治療前比較

圖3 替加環(huán)素降低SEA誘導(dǎo)下PBMC的增殖水平

1：正常組；2：SEA組；3、4、5：1、2、5 mg/L替加環(huán)素組；與正常組比較：##P<0.01；與SEA組比較：**P<0.01

3 討論

替加環(huán)素是四環(huán)素類廣譜抗生素，2006年獲歐洲藥品管理局批準(zhǔn)上市。替加環(huán)素抗菌譜廣，是混合感染情況未明下常用的一線藥物[1]，廣泛用于治療革蘭陰性或陽(yáng)性病原體、厭氧性病原體和耐甲氧西林金葡菌導(dǎo)致的cIAI, 復(fù)雜皮膚及軟組織感染、社區(qū)獲得性肺炎等[8]。已有研究[5,9-12]顯示替加環(huán)素體內(nèi)外作用感染性疾病同時(shí)還兼有一定的抑制炎癥和調(diào)節(jié)免疫活性。Yagnik et al[5]研究發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素體外作用大鼠神經(jīng)元細(xì)胞可有效抑制LPS誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子IL-1和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)的釋放。Pichereau et al[9]報(bào)道替加環(huán)素能夠有效抑制細(xì)菌內(nèi)毒素刺激下人PBMC細(xì)胞分泌干擾素和TNF-a的水平。在動(dòng)物模型上，Salvatore et al[10]考察支原體肺炎小鼠模型發(fā)現(xiàn)，替加環(huán)素治療給藥能夠顯著改善肺部病理，降低支氣管肺泡灌洗液中IL-1、IL-12 (p40/p70) 和 TNF-α表達(dá)水平和炎性趨化因子MIG、MIP-1α和IP-10的含量水平。Parra et al[11]研究確認(rèn)溶血卵磷脂聯(lián)合替加環(huán)素明顯降低實(shí)驗(yàn)性小鼠腹腔敗血癥和肺炎模型炎癥反應(yīng)。臨床研究[4, 12]顯示，替加環(huán)素治療cIAI患者能夠降低患者外周血Ig A水平、升高Ig M和Ig G水平，也能降低患者血清白細(xì)胞、C-反應(yīng)蛋白、一氧化氮合和降鈣素原的含量水平，上述研究提示替加環(huán)素體內(nèi)外均具有一定的抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性。

本研究首先顯示替加環(huán)素治療cIAI患者總有效率為70.8%，對(duì)分離出來(lái)的數(shù)十種致病菌均有較高清除率，這些結(jié)果與文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道基本相一致。此外本研究還顯示替加環(huán)素治療給藥后能夠降低cIAI患者血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IL-8表達(dá)水平，可顯著提高外周血CD3+、CD4+百分比和CD4+/CD8+比值，降低CD8+百分比。CD3+是T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD4+是輔助性T細(xì)胞的表面標(biāo)志物，CD8+是細(xì)胞毒性T細(xì)胞的表面標(biāo)志物。CD4+亞群細(xì)胞可通過(guò)增強(qiáng)、誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，CD8+亞群細(xì)胞主要通過(guò)分泌抑制因子對(duì)系統(tǒng)免疫起著負(fù)向調(diào)節(jié)作用[15]。本研究中顯示，與正常組相比，cIAI組CD3+、CD4+百分比明顯降低，CD4+/CD8+比值明顯降低，CD8+百分比明顯升高，提示機(jī)體CD4+介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)不足以對(duì)抗病原體感染，需借助CD8+清除感染源的生物作用來(lái)維持機(jī)體需求。替加環(huán)素能夠使的這些參數(shù)指標(biāo)接近正常組水平，提示替加環(huán)素整體給藥能夠調(diào)節(jié)患者體內(nèi)的免疫失衡。

為進(jìn)一步探討替加環(huán)素是否對(duì)cIAI患者免疫系統(tǒng)具有直接作用，本研究繼續(xù)考察替加環(huán)素體外對(duì)SEA刺激下cIAI患者外周血PBMC 增殖水平和炎性細(xì)胞因子含量水平。研究結(jié)果顯示替加環(huán)素可直接下調(diào)SEA刺激下PBMC的增殖水平，降低IL-1β、IL-6和IL-8的含量水平，提示替加環(huán)素對(duì)cIAI患者免疫細(xì)胞具有直接調(diào)控作用。一般認(rèn)為，感染導(dǎo)致的機(jī)體組織產(chǎn)生的非特異性炎癥反應(yīng)是一種自我保護(hù)機(jī)制，但過(guò)度活化免疫反應(yīng)會(huì)對(duì)組織造成一定的損傷并加重疾病進(jìn)展。當(dāng)前研究顯示替加環(huán)素在發(fā)揮抗感染作用同時(shí)，可體內(nèi)外作用cIAI患者免疫細(xì)胞，提示替加環(huán)素臨床用于治療混合感染所產(chǎn)生的療效除了與抑制病原微生物生存之外，還與其調(diào)控機(jī)體內(nèi)免疫失衡有關(guān)，值得思考的是該作用可能是其獨(dú)立的活性體現(xiàn)，而與抗微生物作用無(wú)關(guān)。

綜上所述，替加環(huán)素可調(diào)控cIAI患者免疫反應(yīng)，降低外周血PBMC增殖水平、炎性細(xì)胞因子含量水平，恢復(fù)外周血CD4+和CD8+之間的平衡。

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