腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織和外周血HOPX基因甲基化的檢測

侯保森，徐培坤，王 斌，李顯雄，李式浩，曹 明

HOPX基因(基因庫編碼為：NT022853)最初發(fā)現(xiàn)被認為是一種參與調(diào)節(jié)心臟生長發(fā)育與心力衰竭相關(guān)的一種基因[1]，近年來研究[2-4]推測HOPX基因是一種抑癌基因，并且HOPX基因甲基化現(xiàn)象在多種腫瘤如乳腺癌、胰腺癌及結(jié)直腸癌等中均有報道，而HOPX基因的甲基化狀況在腦膠質(zhì)瘤中尚未見報道。該實驗通過對腦膠質(zhì)瘤患者HOPX罕甲基化狀態(tài)的檢測并分析其與膠質(zhì)瘤患者臨床及病理資料的關(guān)系，以探討HOPX基因甲基化在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2016年1月～2017年2月在安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)治療且術(shù)后病理診斷為腦膠質(zhì)瘤患者52例，收集其腫瘤組織及血漿標本為實驗組。其中男20例，女32例，年齡2～79歲，中位年齡48歲；幕上腫瘤46例，幕下腫瘤6例；星形細胞瘤26例，膠質(zhì)母細胞瘤14例，少突膠質(zhì)細胞瘤6例，室管膜瘤4例，髓母細胞瘤2例；低級別膠質(zhì)瘤(WHOⅠ～Ⅱ級)18例，高級別膠質(zhì)瘤(WHO Ⅲ～Ⅳ級)34例。病例入組標準：① 經(jīng)術(shù)后病理確診為腦膠質(zhì)瘤；② 顱內(nèi)單發(fā)腫瘤，既往無手術(shù)、放療、化療及靶向藥物治療史；③ 排除合并有顱內(nèi)其他性質(zhì)腫瘤及全身其他部位腫瘤者；另收集20例顱腦外傷手術(shù)中棄除的壞死腦組織及患者相應(yīng)的外周血血漿標本作為對照組，男14例，女6例，年齡22～65歲，中位年齡46歲。所有提取的組織標本及外周血漿標本均迅速移至-80 ℃冰箱中冷凍儲存。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準通過，所有患者或家屬均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本DNA提取 取組織標本10 mg充分研磨，外周血血漿標本取樣200 μl，采用上海生工生物工程公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(貨號：SK8224)并按其說明書操作步驟提取標本DNA，用紫外-可見分光光度計(U-3010 Hitachi公司)檢測DNA的濃度及純度。

1.2.2DNA亞硫酸氫鈉修飾 步驟如下：① 取2 μg DNA稀釋至50 μl，加NaOH 5.5 μl，42 ℃水浴30 min，加入10 mmol/L對苯二酚30 μl和3.6 mmol/L 亞硫酸氫鈉520 μl ,避光混勻后加石蠟油200 μl水浴 16 h(50 ℃)；② 吸取混合液至1.5 ml EP管中，加300 μl結(jié)合液(6 mmol/L鹽酸胍)后移到UNIQ柱中，室溫靜置2 min，離心1 min(8 000 r/min)，加洗液650 μl, 以8 000 r/min 在室溫條件下離心1 min，重復清洗一次，12 000 r/min 室溫離心1 min；置UNIQ柱于一新的1.5 ml的EP管中，55 ℃烘箱放置10 min，加入雙蒸水50 μl，55 ℃烘箱放置20 min，12 000 r/min 室溫離心2 min，收集洗脫液使終體積為50 μl；③ 加3 mmol/L NaOH 5.5 μl，室溫放置15 min，加3 mmol/L乙酸鈉8 μl、10 g/L糖原4 μl及270 μl冰無水乙醇，-20 ℃沉淀，12 000 r/min離心10 min沉淀DNA，室溫干燥5 min，加30 μl DDW溶解沉淀后待檢。

1.2.3PCR擴增 甲基化和非甲基化引物序列由上海生工生物工程公司設(shè)計，甲基化引物M-F：5′-GTTTTAAAGCGTTAATTTATTGCG-3′,58.6 bp,M-R: 5′-ACAAATCGCGAAAATAAATTCG -3′, 59.5 bp；非甲基化引物U-F：5′-GAGGGTTTTAAAGTGTTAATTTATTGTG-3′,59.6 bp；U-R：5′-CTTAACAAATCACAAAAATAAATTCACC-3′，60 bp。PCR反應(yīng)體系為：模板2 μl+引物F/R各0.5 μl + dNTP 0.5 μl+ Taq Buffer 2.5 μl + MgCl22 μl+ Taq 酶0.2 μl+水16.8 μl。PCR 循環(huán)參數(shù): 95 ℃預變性240 s，94 ℃變性25 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環(huán)，72 ℃修復延伸300 s，PCR擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，上海富山凝膠成像系統(tǒng)軟件進行圖像處理，電泳圖見圖1、2。

1.2.4PCR產(chǎn)物測序 步驟為：① 標本DNA提取及亞硫酸氫鈉修飾：反應(yīng)步驟同前；② PCR擴增引物由上海生工生物工程公司設(shè)計，HOPX基因引物F：5′-GGTGTGTAGTTTTGTTTGGAGAGG-3′；R：5′-ATCCCCTTAAAAACTTCCTCCC-3′， PCR體系：模板3 μl+引物1 μl+ dNTP 1 μl + TaqBuffer 5 μl+ Taq酶0.8 μl+水38.2 μl)；PCR反應(yīng)條件：98 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，66 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共20個循環(huán)，94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共20個循環(huán)，72 ℃修復延伸8 min；③ PCR電泳與回收并將PCR純化產(chǎn)物連接到pUC18-T載(10 μl的連接反應(yīng)體系：10× Ligation Buffer+50%PEG+pUCm-T Vector+PCR產(chǎn)物+T4DNA Ligase+H2O)；④ 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化：取100 μl感受態(tài)細胞冰上完全解凍后加連接液10 μl，置冰上30 min，水浴熱激(42 ℃)60 s，置冰上10～15 min，加400 μl LB培養(yǎng)基， 200～250 r/min振蕩培養(yǎng)(37 ℃)1 h，室溫離心5 min，吸掉上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細胞懸浮。將細菌涂布預先用20 μl(100 mmol/L)IPTG和100 μl 20 g/L X-gal 涂布的氨芐青霉素平板上；⑤ 藍白斑篩選：挑取在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落，移至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜直至克隆完成；⑥ 質(zhì)粒提取并測序：本實驗測序工作由上海生工生物工程公司完成。若胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾等處理后仍保持不變則為發(fā)生甲基化現(xiàn)象，見圖3；若胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾等處理后變?yōu)樾叵汆奏t為未發(fā)生甲基化現(xiàn)象，見圖4。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較選用χ2或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 膠質(zhì)瘤組織HOPX基因甲基化檢測電泳圖

圖2 膠質(zhì)瘤患者外周血血漿HOPX基因甲基化檢測電泳圖

圖3 發(fā)生HOPX基因甲基化的基因測序圖

圖4 未發(fā)生HOPX基因甲基化的基因測序圖

項目腫瘤組織甲基化未甲基化χ2值P值外周血漿甲基化未甲基化χ2值P值性別3．0360．0810．3060．580 男173146 女20122012年齡(歲)0．0460．8300．9080．341 <48166166 ≥482191812腫瘤部位0．0001．0002．0700．150 幕上33132818 幕下4260病理類型0．823?0．941? 星形細胞瘤2061610 膠質(zhì)母細胞瘤9586 少突膠質(zhì)細胞瘤4242 室管膜瘤3131 髓母細胞瘤1120病理級別0．0150．9020．5690．451 低級別(Ⅰ～Ⅱ)135135 高級別(Ⅲ～Ⅳ)24102113

*采用Fisher確切概率法

2 結(jié)果

2.1實驗組與對照組的甲基化狀態(tài)比較實驗組腦膠質(zhì)瘤組織發(fā)生HOPX基因甲基化的甲基化率為71.15%(37/52)高于對照組壞死腦組織的甲基化率20.0% (4/20)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，實驗組腦膠質(zhì)瘤患者外周血血漿和對照組顱腦外傷患者外周血血漿中HOPX基因甲基化率分別為65.38%(34/52)和15.0%(3/20)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2HOPX基因甲基化與腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理資料的關(guān)系腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及外周血中HOPX基因甲基化狀態(tài)與患者性別、年齡、病理類型、腫瘤部位、病理分級間無明顯相關(guān)性，見表1。

3 討論

作為神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，雖然近年來腦膠質(zhì)瘤的治療方法發(fā)展迅速，然而臨床治療效果的提高仍未獲得突破性進展[5]，通過對實驗組及對照組 HOPX基因甲基化狀態(tài)檢測顯示，實驗組腦膠質(zhì)瘤組織中HOPX基因甲基化率顯著高于對照組壞死腦組織中HOPX基因甲基化率，同時實驗組腦膠質(zhì)瘤患者外周血血漿中HOPX基因甲基化率顯著高于對照組顱腦外傷患者外周血血漿中HOPX基因甲基化率，因此可以推測 HOPX基因甲基化可能與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。本研究還顯示，HOPX基因甲基化率與腦膠質(zhì)瘤患者性別、年齡、病理類型、腫瘤部位、病理分級間均無明顯相關(guān)性，提示HOPX基因甲基化可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的一項獨立危險因素。

本課題組在前期的研究[6-7]顯示，腦膠質(zhì)瘤有多種基因如ppENK、EDNRB、p16等基因均存在甲基化現(xiàn)象。本實驗結(jié)果與本課題組前期多種基因甲基化檢測的不同之處包括以下兩方面：① 無論是在組織中還是在外周血血漿中，HOPX基因啟動子區(qū)甲基化率均高于前期所檢測的其他基因；② 在前期檢測的基因中，對照組均未發(fā)現(xiàn)基因甲基化現(xiàn)象，而本實驗檢測出對照組也發(fā)生了基因甲基化現(xiàn)象，但對照組的甲基化率顯著低于實驗組，提示腦膠質(zhì)瘤中HOPX基因甲基化檢測具有較高靈敏度和較低特異度的特點。

目前腦膠質(zhì)瘤的診斷仍主要依靠術(shù)前的影像學資料及術(shù)后的病理予以確診，最終的診斷有賴于腫瘤組織的獲取，然而在臨床工作中腦腫瘤組織的獲取相對較為困難且有一定的風險，也不能反映腫瘤的動態(tài)變化信息，更不能達到早期診斷的目的，而外周血標本的獲取取材方法簡單，可減少診斷過程中對患者的損傷，且能反映腫瘤的動態(tài)變化信息，具有“精準醫(yī)學”特征，近年來已有許多與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系的外周血腫瘤標志物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[8]。本研究顯示，實驗組腦膠質(zhì)瘤患者外周血血漿中HOPX基因甲基化率顯著高于對照組顱腦外傷患者外周血血漿HOPX基因甲基化率，因此可認為HOPX基因甲基化檢測可作為一種新的具有特征性的外周血腫瘤標志物，有望成為腦膠質(zhì)瘤的早期診斷的一種方便、快捷、微創(chuàng)的分子生物學檢測手段。本課題組在前期的基因甲基化研究[7]中顯示，單基因甲基化檢測的靈敏度較低，而通過兩種基因聯(lián)合檢測的方法可提高診斷的靈敏度，提高了早期診斷的價值，而本實驗檢測結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤中HOPX基因甲基化檢測具有較高靈敏度和較低特異度的特點，因此可以推測加入高靈敏度的HOPX基因進行多基因甲基化狀態(tài)的檢測，可進一步提高檢測的靈敏度和檢測的特異度，進而達到早期診斷、精準診斷、動態(tài)觀察的目的，后期課題組擬開展包括HOPX基因在內(nèi)的多種基因甲基化的聯(lián)合檢測，進一步了解多種基因的甲基化率及靈敏度和特異度情況。

抑癌基因的甲基化現(xiàn)象存在于多種腫瘤細胞中，DNA甲基化使腫瘤抑制基因發(fā)生沉默從而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但DNA甲基化是一種可逆性改變，通過去甲基化處理可以達到防治腫瘤的目的[9]，現(xiàn)已有多種去甲基化藥物被發(fā)現(xiàn)[10]。在本實驗中HOPX基因在實驗組膠質(zhì)瘤患者中甲基化率遠高于對照組，因此可推測HOPX基因的去甲基化有望成為腦膠質(zhì)瘤治療的一個靶點，后期課題組將通過進一步的實驗尋找HOPX基因去甲基化藥物，從而為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。

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