種植前遺傳學(xué)診斷/篩查周期的臨床資料分析

向卉芬，徐祖瀅，張 影，郝 燕，陳大蔚，章志國，周 平，曹云霞

遺傳性疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病之一。1990年世界首例種植前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)技術(shù)嬰兒的誕生，開辟了人類干預(yù)遺傳性疾病的新紀(jì)元[1]。PGD是指在移植之前對胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測，確定胚胎的遺傳組成，選擇正?；驔]有發(fā)病風(fēng)險的胚胎移植，避免有遺傳病發(fā)病風(fēng)險的嬰兒出生。種植前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening，PGS)技術(shù)是指在移植前對早期胚胎進(jìn)行非整倍體篩查，挑選正常的胚胎移植，以期提高種植率，降低流產(chǎn)率。診斷技術(shù)包括PCR技術(shù)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術(shù)、微陣列比較基因組雜交技術(shù)(array comparative genomic hybridization，array-CGH)、二代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)等。該文回顧性分析了實(shí)施PGD/PGS技術(shù)的共309個治療周期的資料，包括對病因構(gòu)成、治療過程及臨床結(jié)局的分析和總結(jié)，旨在為臨床上PGD/PGS的具體實(shí)施提供參考。

1 材料與方法

1.1資料來源

1.1.1病例資料 2009年1月～2016年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行PGD/PGS助孕的283對夫婦的309個治療周期的資料。

1.1.2PGD適應(yīng)證 ① 夫婦一方或雙方染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常；② 基因??；③ 性連鎖遺傳??；④ HLA配型；⑤ 癌癥易感基因攜帶者。

1.1.3PGS適應(yīng)證 ① 高齡；② 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)或不良妊娠史；③ 反復(fù)種植失敗。

1.2研究方法

1.2.1治療過程 有PGD/PGS適應(yīng)證的患者，根據(jù)基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平及超聲下竇卵泡計數(shù)，選擇合適的促排卵方案，采用經(jīng)陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，當(dāng)主導(dǎo)卵泡群至合適大小時，肌注人絨毛膜促性腺激素5 000～10 000 IU，36 h后經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。減數(shù)第2次分裂中期(metaphase Ⅱ, MⅡ)的卵子常規(guī)行單精子卵胞漿內(nèi)注射受精，16～18 h后觀察受精情況，受精后2～5 d觀察并記錄卵裂及胚胎發(fā)育情況。所有活檢過程采用激光透明帶打孔法。

1.2.2FISH法 48個周期采用FISH法進(jìn)行診斷。受精后第3天，胚胎發(fā)育至6～10細(xì)胞時，活檢取出1～2個卵裂球，轉(zhuǎn)移至載玻片上，加入細(xì)胞裂解液(0.01 mol/L HCL+1%Tween20)并注意標(biāo)注細(xì)胞核的位置。經(jīng)PBS及梯度乙醇(50%，70%，100%)溶液各脫水2 min后置于消化液(0.1 mg/ml 胃蛋白酶+0.01 mol/L HCL)37 ℃水浴條件下處理10 min。過蒸餾水，經(jīng)固定液(1%多聚甲醛)5 min固定后再依次經(jīng)PBS 和上述梯度乙醇各脫水2 min。將每張片加探針約2 μl，加蓋蓋玻片，封片，啟動雜交過程后置于37 ℃濕盒過夜。次日晨洗片，待玻片避光自然晾干后滴加含染核劑的抗熒光淬滅劑AntifadeⅡ，放置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。活檢后的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，于第5天根據(jù)FISH結(jié)果選擇胚胎移植。診斷異常、失敗或胚胎質(zhì)量差的胚胎則不予移植。

1.2.3array-CGH法 225個周期采用array-CGH法進(jìn)行診斷。受精后5～6 d，胚胎發(fā)育至囊胚期時，活檢取5～10個滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，利用Sure Plex DNA Amplification System 試劑盒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Cy3-Cy5 熒光標(biāo)記并雜交于Blue Gnome 24 sure V3 芯片上。洗片后，通過Inno Scan 710 掃描儀掃描和Blue Fuse Multi 軟件分析后獲得數(shù)據(jù)。將活檢后的胚胎編號冷凍。根據(jù)診斷結(jié)果，選擇診斷正常的胚胎行凍融胚胎移植。診斷異?；虿幻鞔_的胚胎不予移植。

1.2.4NGS法 36個周期采用NGS法進(jìn)行診斷。受精后5～6 d，胚胎發(fā)育至囊胚期時，活檢取5～10個滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，MDA法全基因組擴(kuò)增，將產(chǎn)物純化檢測后，用life tech 和ION XPRESS LIBRARY KIT構(gòu)建文庫，獲得數(shù)據(jù)后分析。將活檢后的胚胎編號冷凍。根據(jù)診斷結(jié)果，選擇診斷正常的胚胎行凍融胚胎移植。診斷異?；虿幻鞔_的胚胎不予移植。

1.2.5妊娠的確認(rèn)和隨訪 移植后14 d測定血中人絨毛膜促性腺激素水平確定是否妊娠，移植后30 d B超檢測胎心及胚胎發(fā)育情況。妊娠者均隨訪至分娩并詳細(xì)記錄產(chǎn)前診斷、母嬰情況、新生兒孕周、出生體重、有無出生缺陷等。

2 結(jié)果

2.1女性患者的基本臨床資料本中心自2009年起開展PGD/PGS技術(shù)以來，有283對夫婦接受治療，共行309個周期。其中女性患者的平均年齡為(29.37±4.76)歲，不孕年限為(3.15±2.73)年，身高體重指數(shù)(body mass index，BMI)為(22.25±2.88) kg/m2, 基礎(chǔ)卵泡刺激素(basic follicle stimulating hormone, bFSH)為(6.58±1.63) IU/L, 基礎(chǔ)促黃體生成素(basic luteinizing hormone, bLH)為(4.99±2.54) IU/L。

2.2實(shí)施PGD/PGS夫婦的病因構(gòu)成分析283對夫婦中，因一方或雙方染色體異常行PGD治療的共有223例，占78.8%，其中男性異常有131例，女性異常有89例，3例為夫妻雙方均有異常。因基因病行PGD治療的有4例，占1.4%，其中1例為杜氏肌營養(yǎng)不良致病基因攜帶者采用FISH技術(shù)行性別選擇，另3例分別為先天性成骨發(fā)育不全患者、多囊腎患者、先天性耳聾基因攜帶者，均采用NGS法診斷；因不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)或不良妊娠史(38例)、反復(fù)種植失敗(13例)和高齡(5例)行PGS治療的共有56例，占19.8%。

2.3PGD/PGS實(shí)施情況分析

2.3.1FISH、array-CGH和NGS 3種診斷方法的比較 分析通過FISH、array-CGH和NGS這3種方法診斷的309個PGD周期，比較這3種方法的診斷效率，結(jié)果顯示：FISH組的年齡小于NGS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；FISH組的獲卵數(shù)和平均活檢胚胎數(shù)多于array-CGH組和NGS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；array-CGH組的活檢成功率高于FISH組和NGS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；FISH組的無胚胎移植周期比率低于array-CGH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)ISH組的正常胚胎率高于array-CGH和NGS組，但胚胎種植率低于array-CGH組和NGS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)ISH組的臨床妊娠率低于NGS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3種方法患者的BMI、卵巢基礎(chǔ)情況、Gn用量、Gn天數(shù)、受精數(shù)、卵裂數(shù)、流產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.3.2不同病因行PGD/PGS臨床妊娠率比較 因女方、男方染色體異常、反復(fù)流產(chǎn)或不良妊娠史和反復(fù)種植失敗行PGD/PGS治療的臨床妊娠率分別為：48.7%、46.3%、46.2%和25.0%，各組間妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

2.3.3因染色體易位行PGD周期的分析 染色體易位可包括羅伯遜易位和相互易位， 通過PGD技術(shù)可以有效地篩除因非均衡的配子導(dǎo)致早期胚胎遺傳物質(zhì)不均衡的的異常胚胎，改善這類患者臨床結(jié)局。針對這兩種易位類型，本中心采用array-CGH技術(shù)共實(shí)施113個PGD周期，其中羅伯遜易位43個周期，相互易位70個周期，比較這兩組患者各項(xiàng)指標(biāo)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，詳細(xì)見表2。

圖1 不同病因行PGD/PGS臨床妊娠率比較

2.4PGD/PGS出生子代情況截止2016年12月，隨訪出生新生兒共70例，均未顯示有出生缺陷。由于應(yīng)用NGS法僅出生4例，數(shù)量太少，故只比較FISH和array-CGH兩種診斷方法出生的新生兒。其性別比、身長及體重差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

3 討論

正如前面介紹，PGD臨床上一般應(yīng)用于以下患者：① 染色體異常，包括夫妻任意一方的異?；蛘唠p方染色體異常。其中，染色體易位(相互易位、羅氏易位)、倒位、嵌合體、性染色體異常(包括Y染色體微缺失)等均包含在內(nèi)。染色體異?？梢栽跍p數(shù)分裂過程中形成異常的配子，導(dǎo)致不孕不育、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、甚至生育畸形或智力低下的胎兒、死胎死產(chǎn)等。染色體異常在一般人群中的發(fā)生率為0.5%～1.0%，在有不良孕產(chǎn)史人群中的發(fā)生率則可達(dá)2%～10%[2]。因此，PGD技術(shù)可幫助因染色體異常而不孕的夫婦進(jìn)行胚胎活檢，從而降低流產(chǎn)風(fēng)險，獲得正常后代。本文行PGD/PGS助孕的283例患者中，因染色體異常行PGD有223對夫婦，占總例數(shù)的78.8%，可見染色體異常是本中心不孕患者行PGD的最主要原因。② 單基因病。本中心有3例單基因病行PGD，其中1例為先天性成骨發(fā)育不全患者，采用NGS法診斷，已生育一健康女嬰；另2例分別是多囊腎患者和先天性耳聾基因攜帶者，均采用NGS法診斷，截至隨訪日，均為持續(xù)妊娠。③ 性連鎖遺傳病。本中心有1例性連鎖遺傳病，為杜氏肌營養(yǎng)不良癥的致病基因攜帶者，采用FISH法行性別選擇，未孕。綜上，因基因病來我中心行PGD共4例，占總例數(shù)的1.4%。本中心暫無因HLA配型或是癌癥易感基因攜帶者行PGD的不孕夫婦。相對于PGD，PGS周期所占比例較少，僅有56對夫婦因不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)或不良妊娠史(38例)、反復(fù)種植失敗(13例)和高齡(5例)來我中心行PGS助孕，占總例數(shù)的19.8%。但隨著二胎政策的全面開放，許多高齡婦女會尋求二胎的生育，PGS的應(yīng)用比例可能會有一定幅度的增加。

表1 采用3種診斷方法的PGD/PGS周期比較±s)

與NGS法比較：*P<0.05；與FISH法比較：**P<0.05；與array-CGH法比較：#P<0.05

表2 因染色體羅伯遜易位和相互易位行array-CGH法PGD周期的比較±s)

表3 FISH和array-CGH法出生子代情況比較±s)

自1994年Harper et al[3]學(xué)者成功采用FISH技術(shù)對胚胎進(jìn)行性別診斷后，F(xiàn)ISH技術(shù)開始逐步應(yīng)用于PGD領(lǐng)域中。該技術(shù)是用帶有熒光標(biāo)記的特異性探針與待測的DNA雜交后，在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，可對染色體異常及性別診斷進(jìn)行檢測分析，具有簡單快速、重復(fù)性好、檢測結(jié)果直觀清晰的優(yōu)點(diǎn)。但運(yùn)用FISH技術(shù)行PGD也存在較多的局限性，包括單細(xì)胞固定實(shí)驗(yàn)技術(shù)的難度和要求較高；分辨率較低，能檢測的染色體數(shù)目也有限；人為判讀FISH檢測的信號結(jié)果，具有一定的主觀性，易導(dǎo)致誤診。近年來，array-CGH和NGS也開始應(yīng)用于PGD的領(lǐng)域中。array-CGH是FISH技術(shù)的一大延伸和突破，相比于FISH技術(shù)，array-CGH技術(shù)有具有高通量，高分辨率，高靈敏度，快速及自動化等優(yōu)點(diǎn)。NGS又稱高通量測序，是DNA測序史上一次劃時代的革命。NGS的優(yōu)勢在于不僅可以對染色體病進(jìn)行診斷，還能通過構(gòu)建單體型與深度捕獲測序相結(jié)合，對單基因病進(jìn)行診斷。隨著單細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展成熟，測序成本和耗時的下降，NGS在PGD/PGS技術(shù)中發(fā)揮了越來越重要的作用[4-5]。

因此本研究比較了FISH、array-CGH和NGS 3種診斷方法在PGD/PGS技術(shù)中的應(yīng)用，顯示FISH組患者年齡相對于其他兩組較小，且與NGS組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可能導(dǎo)致FISH組的獲卵數(shù)、平均活檢胚胎數(shù)和正常胚胎率均多于array-CGH組和NGS組。比較3組技術(shù)的胚胎活檢成功率可顯示array-CGH組的活檢成功率最高，其次為NGS技術(shù)，且array-CGH組與FISH組和NGS組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。從臨床結(jié)局比較上來看，盡管FISH組的患者年齡最小，但其胚胎種植率仍低于array-CGH組和NGS組，且FISH組的臨床妊娠低于NGS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。分析原因，F(xiàn)ISH技術(shù)采用的是卵裂球活檢，僅選取1～2個細(xì)胞進(jìn)行分析，而且卵裂期的胚胎存在較高的嵌合現(xiàn)象，影響PGD診斷的準(zhǔn)確度。而隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)的提高，array-CGH法和NGS法均采用囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢，可以取出5～10個細(xì)胞進(jìn)行分析，既不侵入內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，也降低了因嵌合體、擴(kuò)增失敗等誤診的風(fēng)險，可以提高診斷的效率?，F(xiàn)如今已有文獻(xiàn)[6]表明卵裂期活檢可能會降低胚胎的生育種植潛能，這與本研究的種植率比較結(jié)果一致。在移植方式選擇上，本研究FISH組為兩種移植方式均有，array-CGH組和NGS組均采取凍融胚胎移植，已有的研究[7-8]表明凍融胚胎移植可以降低卵巢過度刺激的風(fēng)險，避免促排卵藥物對子宮內(nèi)膜容受性的影響，從而提高臨床妊娠率。這可能是得到本研究臨床妊娠率比較結(jié)果的原因。值得一提的是，本中心的4例基因病，除1例是性連鎖性基因病行性別選擇外，另外3例均采用NGS法通過建單體型進(jìn)行診斷，NGS技術(shù)彌補(bǔ)了FISH和array-CGH技術(shù)不能診斷性連鎖性以外基因病的缺點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明患者因女性染色體異常、男性染色體異常、反復(fù)流產(chǎn)或不良妊娠史及反復(fù)種植失敗病因行PGD/PGS治療的臨床妊娠率分別為：48.7%、46.3%、46.2%和25.0%，由于因高齡行PGS的例數(shù)很少，臨床結(jié)果仍待商榷，但PGD對染色體異常的患者的后續(xù)發(fā)展具有明顯的促進(jìn)作用。Fischer et al[9]學(xué)者對192例行PGD助孕的有3次及以上流產(chǎn)史的染色體易位攜帶者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)率從行PGD前的88.5%銳減到PGD后的13%，妊娠成功率可達(dá)87%，大大改善了患者的臨床結(jié)局。

隨著PGD/PGS技術(shù)的普及和發(fā)展，有關(guān)PGD/PGS子代安全及倫理問題也成為當(dāng)今的熱點(diǎn)問題之一。Nekkebroeck et al[10]納入了70例經(jīng)PGD/PGS、70例經(jīng)ICSI和70例經(jīng)自然妊娠出生的2歲兒童，比較了3組兒童的心智發(fā)展和精神運(yùn)動能力，發(fā)現(xiàn)其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。之后Winter et al[11]對47例經(jīng)PGD、49例經(jīng)ICSI和48例經(jīng)自然妊娠的5～6歲的兒童進(jìn)行了認(rèn)知發(fā)育和運(yùn)動能力的評估，發(fā)現(xiàn)PGD組的兩項(xiàng)指標(biāo)和其他兩組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但I(xiàn)CSI組和自然妊娠組在運(yùn)動能力的比較中差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究行PGD/PGS出生的新生兒共70例，均無出生缺陷，且通過FISH和array-CGH診斷方法出生的新生兒在性別比、身長及體重上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。但探索PGD/PGS的安全問題，仍需要更長久更完善的隨訪研究。

綜上所述，PGD/PGS技術(shù)是對遺傳病高?；颊叩挠行Ц深A(yù)措施。FISH、array-CGH和NGS 3種診斷方法均是有效的胚胎診斷方法，array-CGH法和NGS法的診斷效率較FISH法高。而NGS技術(shù)可以同時實(shí)現(xiàn)對染色體異常和單基因病的檢測，隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，NGS技術(shù)有望會成為PGD/PGS的主流檢測手段。

[1] Handyside A H, Kontogianni E H, Hardy K, et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification [J]. Nature, 1990, 344(6268):768-70.

[2] 張 明, 高久春, 鄭賢紅,等. 不良孕產(chǎn)史患者467例細(xì)胞遺傳學(xué)分析[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 24(6):998-1000.

[3] Harper J C, Coonen E, Ramaekers F C, et al. Identification of the sex of human preimplantation embryos in two hours using an improved spreading method and fluorescent in-situ hybridization (FISH) using directly labelled probes[J]. Hum Reprod,1994,9(4):721-4.

[4] Simpson J L, Rechitsky S, Kuliev A. Next-generation sequencing for preimplantation genetic diagnosis [J]. Fertil Steril,2013, 99(5):1203-4

[5] Tukaszuk K, Pukszta S, Wells D, et al. Routine use of next-generation sequencing for preimplantation genetic diagnosis of blastomeres obtained from embryos on day 3 in freshinvitrofertilization cycles [J]. Fertil Steril, 2015, 103(4):1031-6.

[6] Scott R T,Upham K M,Forman E J,et al. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial[J]. Fertil Steril,2013,100(3):624-30.

[7] Shapiro B S,Daneshmand S T,Garner F C,et al.Evidence of impaired endometrial receptivity after ovarian stimulation forinvitrofertilization: a prospective randomized trial comparing fresh and frozen-thawed embryo transfer in normal responders[J]. Fertil Steril,2011,96(2):344-8.

[8] Evans J,Hannan N J,Edgell T A,et al.Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence[J]. Hum Reprod Update, 2014,20(6):808-21.

[9] Fischer J, Colls P, Escudero T, et al. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) improves pregnancy outcome for translocation carriers with a history of recurrent losses [J]. Fertil Steril, 2010, 94(1):283-9.

[10] Nekkebroeck J,Bonduelle M,Desmyttere S,et al.Mental and psychomotor development of 2-year-old children born after preimplantation genetic diagnosis or screening[J].Hum Reprod,2008,23(7):1560-6.

[11] Winter C, Van Acker F, Bonduelle M, et al. Cognitive and psychomotor development of 5- to 6-year-old singletons born after PGD: a prospective case-controlled matched study[J]. Hum Reprod,2014,29(9):1968-77.