潰瘍性結(jié)腸炎血小板中鉀通道和NLRP3表達(dá)的臨床意義

葉盛林，梅詠玉，韓 瑋，楊 青，胡 翠，劉曉昌，梅 俏，許建明

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)中腸道炎癥與止血機(jī)制密切相關(guān)[1]，可能與血小板的功能改變有關(guān)，血小板不僅參與止血過程，還可分泌炎癥因子(如IL-1β)，參與炎癥過程[2]。IBD患者的顯著特征包括血小板功能活化，如GPIIb/IIIa、P-選擇蛋白和CD40L表達(dá)增加，其中潰瘍性結(jié)腸炎( ulcerative colitis, UC)患者血小板作為重要的炎癥細(xì)胞也有明顯的功能活化[3]。研究[2]顯示血小板參與炎癥反應(yīng)需要IL-1β信號(hào)和NLRP3炎性小體活化，靜息狀態(tài)血小板可表達(dá)NLRP3、接頭分子，在活化狀態(tài)血小板中兩者共定位組裝成功能性NLRP3炎癥小體，激活procaspase-1形成caspase-1，產(chǎn)生IL-1β等炎癥因子，促進(jìn)炎癥過程。

NLRP3是核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體家族分子中的一種胞內(nèi)型受體，與接頭分子及效應(yīng)分子(caspase-1)組裝成NLRP3炎癥小體。NLRP3炎癥小體的激活需要NF-κB介導(dǎo)炎癥小體前體表達(dá)上調(diào)，招募接頭分子組裝成特定結(jié)構(gòu)，活化pro-caspase-1，產(chǎn)生炎癥因子IL-1β和IL-18。在炎癥性疾病(如自身免疫性疾病、感染、敗血癥)中均有NLRP3炎癥小體的參與[4]。鉀和鈣是激活NLRP3炎癥小體的關(guān)鍵介質(zhì)[5]。Kv1.3通道是血小板的主要電壓門控鉀通道，Kv1.3通道促進(jìn)活化血小板的早期鈣離子內(nèi)流，胞漿內(nèi)鈣離子濃度明顯增加，Kv1.3通道可能通過增加激動(dòng)劑誘發(fā)的Ca2+流入影響血小板活化[6]。血小板中存在中電導(dǎo)的鈣激活的鉀通道(Kca3.1)，可能與Kv1.3一起協(xié)同調(diào)節(jié)血小板內(nèi)外鉀和鈣濃度，影響NLRP3炎癥小體和血小板的活化過程[6-7]。因此，該研究通過檢測(cè)活動(dòng)期UC血小板Kca3.1、Kv1.3和NLRP3的表達(dá)情況，探討潰瘍性結(jié)腸炎血小板中NLRP3表達(dá)與鉀通道的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院明確診斷的UC患者17例，年齡19～64(38.71±14.12)歲，采用改良Mayo評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疾病活動(dòng)性評(píng)分，17例UC均為活動(dòng)期，其中輕度3例，中度9例，重度5例。按2012年我國(guó)炎癥性腸病診斷共識(shí)意見(廣州)作為UC診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。正常對(duì)照組為經(jīng)體檢均合格及近3個(gè)月無胃腸道癥狀的11例健康志愿者，年齡24～55(35.00±9.86)歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2標(biāo)本采集收集患者入院后(24 h內(nèi))次日晨的5 ml全血，立即低速離心(1 300 r/min，15 min)獲取富血小板血漿(PRP)，取出PRP再次離心(3 000 r/min，20 min)去除血漿后，獲取血小板于-80 ℃保存。

1.3RT-PCR方法檢測(cè)血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的mRNA表達(dá)將血小板解凍，加入TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)勻漿裂解，再依次以氯仿、異丙醇、75℅乙醇(DEPC水配制)抽提，獲取干燥RNA沉淀后，加入DEPC水溶解得總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，總RNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 。GAPDH作為內(nèi)參，按試劑盒說明書(德國(guó)Qiagen公司)的步驟進(jìn)行加樣擴(kuò)增獲取RT-PCR產(chǎn)物，引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度，反應(yīng)條件均為97 ℃、5 min，93 ℃、30 s，52 ℃、30 s，70 ℃、40 s，36個(gè)循環(huán)；70 ℃、10 min，4 ℃、10 min。紫外凝膠成像系統(tǒng)分析各樣本中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的表達(dá)情況。見表1。

表1 RT-PCR引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4Westernblot方法檢測(cè)血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的蛋白表達(dá)取血小板解凍，裂解(RIPA細(xì)胞裂解液)后，離心取上清液，按照1 ∶4加入的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min后上樣(每孔15 μl)，電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，完成后洗去轉(zhuǎn)膜液加Western封閉液(5%脫脂奶粉)封閉2 h。參考一抗及二抗說明書，按照合適的比例滴加一抗稀釋液(Kca3.1抗體屬性為兔抗1 ∶200 稀釋；Kv1.3抗體屬性為鼠抗1 ∶500稀釋；NLRP3抗體屬性為兔抗1 ∶200稀釋)，4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。加入洗滌液(PBST)洗滌3次，每次洗滌10 min，按照相應(yīng)比例加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗稀釋液。室溫孵育2 h。加入洗滌液(PBST)洗滌8 h，洗滌3次。最后用ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo公司)進(jìn)行蛋白檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3mRNA表達(dá)水平的改變與正常對(duì)照組相比，UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3 mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 RT-PCR法檢測(cè) Kca3.1、Kv1.3和NLRP3在正常和UC血小板中的表達(dá)

2.2UC患者血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3mRNA表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián)分析輕、中、重度三組UC患者，Kca3.1 、Kv1.3、NLRP3 mRNA表達(dá)均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 不同嚴(yán)重程度UC血小板中Kca3.1、Kv1.3和NLRP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)

2.3UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表達(dá)水平的改變與正常對(duì)照組比較，UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.4UC患者血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián)分析輕、中、重度三組UC患者中血小板Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表達(dá)進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示血小板Kca3.1、Kv1.3及NLRP3 蛋白表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度無明顯相關(guān)性。

圖2 Western blot法檢測(cè) Kca3.1、Kv1.3和NLRP3在正常和UC血小板中的表達(dá)

2.5UC患者血小板中NLRP3蛋白與Kca3.1、Kv1.3蛋白表達(dá)水平的相關(guān)分析相關(guān)分析顯示，Kca3.1與NLRP3的蛋白表達(dá)水平明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.877，P<0.01)(圖3)；Kv1.3與NLRP3的蛋白表達(dá)水平有一定的相關(guān)趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。UC患者血小板Kca3.1、Kv1.3與NLRP3 蛋白表達(dá)水平分別與紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate ，ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein ，CRP)、Mayo評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，均無明顯相關(guān)性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

圖3 NLRP3和Kca3.1在蛋白質(zhì)水平的相關(guān)性分析

3 討論

UC以反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性腸道炎癥為特征，發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。研究[3-4]顯示，血小板炎癥反應(yīng)參與了UC的病理生理過程，在小鼠DSS結(jié)腸炎模型中發(fā)現(xiàn)活化血小板數(shù)量明顯增加[9]。血小板作為重要的炎癥細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中具有關(guān)鍵作用，活化的血小板可以通過多種機(jī)制介導(dǎo)炎癥和免疫應(yīng)答，包括釋放促炎、抗炎及血管生成因子，募集炎細(xì)胞到血管損傷和炎癥部位[10]。研究[2]顯示受登革熱病毒感染患者體內(nèi)血小板被激活及NLRP3-caspase-1炎癥小體組裝并介導(dǎo)血小板微粒中的IL-1β分泌，刺激血管內(nèi)皮，導(dǎo)致通透性增加，加重滲出及炎癥反應(yīng)，IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)及NLRP3炎性小體活化參與血小板炎癥過程。NLRP3基因與UC的易感性相關(guān)，可能在UC發(fā)病過程中起重要作用。研究[11]顯示NLRP3炎癥小體在DSS結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織中高表達(dá)，槐耳提取液通過降低結(jié)NLRP3及IL-1β表達(dá)，改善結(jié)腸炎癥。NLRP3是NLRP3炎癥小體的關(guān)鍵組成部分，是NLRP3炎性小體激活的限速步驟[12]。因此，根據(jù)研究結(jié)果推測(cè)血小板中NLRP3的表達(dá)改變所致的炎癥損傷可能與UC的發(fā)生過程有關(guān)。

表3 UC患者血小板蛋白質(zhì)表達(dá)水平與ESR、CRP和Mayo評(píng)分的相關(guān)性分析

血小板中主要存在Kv和Kca兩種類型鉀通道，分別以Kv1.3和Kca3.1為主[6-7,13]。Mahaut-Smith[7]研究發(fā)現(xiàn)血小板存在Ca2+依賴性K+通道(Kca通道)。使用膜片鉗技術(shù)證實(shí)血小板中存在高密度電壓門控K+通道(Kv通道)和Kca通道[6-7]。研究[6,14]顯示血小板Kv1.3通道與血小板活化有關(guān)，Kca3.1可能參與此過程，鉀離子通過鉀通道外流所致的細(xì)胞內(nèi)低鉀是導(dǎo)致NLRP3炎癥小體活化重要條件，抑制鉀離子外流可抑制NLRP3炎癥小體的活化。相關(guān)研究[15]顯示K+外排可能是所有NLRP3刺激致NLRP3激活所必需的共同特征。因此，UC中血小板Kv1.3、Kca3.1鉀通道與NLRP3炎癥小體的表達(dá)是否改變目前尚不清楚。

本研究顯示， UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，提示血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的過表達(dá)可能參與UC的病理生理過程；而Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的表達(dá)水平與UC的嚴(yán)重程度以及CRP、ESR及Mayo評(píng)分等均無明顯相關(guān)性，進(jìn)一步提示以上三種物質(zhì)的表達(dá)可能與病情嚴(yán)重程度及活動(dòng)性無關(guān)。研究[3,6,14]顯示，UC中血小板明顯活化，血小板活化與鉀通道和NLRP3炎癥小體活化有關(guān)，推測(cè)UC血小板中Kca3.1、Kv1.3可能引起胞液內(nèi)鉀和鈣離子濃度改變，進(jìn)一步改變NLRP3活化過程，促進(jìn)血小板活化，參與UC的炎癥過程。另一方面，NLRP3與Kca3.1、Kv1.3蛋白表達(dá)水平有一定相關(guān)，提示UC血小板中NLRP3過表達(dá)與血小板中的鉀通道增多可能有關(guān)。因此，推測(cè)由于感染等誘因，引起UC血小板中Kca3.1和Kv1.3鉀通道明顯增多及血小板內(nèi)外鉀鈣離子濃度改變，促進(jìn)NLRP3表達(dá)及NLRP3炎癥小體活化，促進(jìn)血小板活化，釋放炎癥因子，促進(jìn)UC腸道炎癥的發(fā)生，但UC血小板活化的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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