桔?？傇碥罩委煷笫笞魟┬躁P(guān)節(jié)炎的作用及其對GRP78/ XBP1/CHOP信號(hào)通路的影響

陳昭琳，李 俊，馬陶陶，黃 成，沈愛宗，唐麗琴，張善堂，朱鵬里

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以持續(xù)、反復(fù)發(fā)作、全身性關(guān)節(jié)腫痛等為主要特征的慢性自身免疫性疾病[1]。目前臨床上治療RA的藥物雖可有效緩解RA患者的癥狀，但普遍存在長期使用所伴隨的毒副作用，因此尋找高效低毒的藥物就成為臨床迫在眉睫的需求。

桔梗為桔?？浦参锝酃Platycodongrandiforus(Jacq.) A.DC]的干燥根，桔梗皂苷(Platcodongrandiflorumtotal saponins, CKS)是其主要的藥理活性成分，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[2-3]。近年大量研究[4-5]顯示，RA發(fā)病過程中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)的參與。目前關(guān)于ERS與CKS在RA中的實(shí)驗(yàn)研究尚未見報(bào)道。因此該課題利用弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的AA大鼠模型，通過灌胃給予CKS干預(yù)后，觀察其對AA大鼠的治療作用并深入探討其作用機(jī)制，為CKS在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床治療上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 60只清潔級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(180±20) g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2藥物與試劑 CKS由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提取純化，總皂苷含量>80%；弗氏完全佐劑購自美國sigma公司；來氟米特購自蘇州長征-欣凱制藥有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)和白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)試劑盒均購自美國R & D公司；蛋白裂解液(RIPA)、一抗稀釋液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；GRP78抗體購自美國Abcam公司；CHOP抗體購自美國Bioworld公司；XBP1、TNF-α、β-actin抗體購自美國Cell signal生物技術(shù)公司；二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TRIzol Reagent RNA提取試劑購自美國 Invitrogen公司；SYBR Green逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；PCR引物均由上海生工生物工程有限公司合成。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器 電子天平FA2004A(上海精天電子儀器廠)；足趾容積測量儀PV-200(成都泰盟科技有限公司)；全波長酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)；DL-5000B低速冷凍離心機(jī)(上海安亭公司)；5415R型高速冷凍離心機(jī)、Mastercycle epgradient Eppendorf PCR儀(德國Eppendorf公司)；NIB-100倒置顯微鏡(寧波永新公司)；Power-Pac Basic電泳儀、半干轉(zhuǎn)儀(美國伯樂公司)；ABI9700型PCR儀(美國ABI公司)。

1.2方法

1.2.1AA大鼠模型的建立 所有大鼠購進(jìn)之后進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，待大鼠適應(yīng)環(huán)境后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用弗氏完全佐劑(0.1 ml)注射大鼠左后足趾皮內(nèi)造模使其致炎，正常組給予同等體積的生理鹽水。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組與給藥方案 60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、CKS低、中、高劑量組(50、100、200 mg/kg)和陽性藥來氟米特組(2 mg/kg)，每組10只。自致炎后第12天開始，采用灌胃方式給藥，每日1次，連續(xù)12 d給藥，同時(shí)，正常組和模型組分別給予與給藥組等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，于第28天處死大鼠檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3大鼠繼發(fā)性足腫脹的測定及多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(polyarthritis index, PI)評(píng)分 于給藥前1天用足腫脹測量儀測量大鼠非致炎側(cè)(右側(cè))后足爪容積，并分別于給藥開始即造模后第12、16、20、24、28天測定大鼠右后足爪容積，計(jì)算大鼠足腫脹度的變化情況，足腫脹度計(jì)算公式為：Δml=致炎后足趾容積的平均值-致炎前足趾容積的平均值；同時(shí)，觀察各組大鼠在第12、16、20、24、28天全身關(guān)節(jié)病變程度，按照5級(jí)評(píng)分法評(píng)分，計(jì)算出PI：0=無紅腫；1=趾關(guān)節(jié)紅腫；2=趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3=踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4=包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。累積四肢的評(píng)分即為每只大鼠的 PI，其最大值為12。

1.2.4血清中指標(biāo)檢測 造模后第28天，股動(dòng)脈處死各組大鼠并取血，采用離心管收集后于4 ℃離心(3 000 r/min，10 min)，取上層血清按照TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒操作步驟檢測血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.2.5病理形態(tài)學(xué) 每組隨機(jī)選取2只大鼠，處死后取左后足爪置于10%的福爾馬林中固定，隨后根據(jù)病理流程常規(guī)操作，最后進(jìn)行石蠟包埋切片和蘇木精-伊紅染色。顯微鏡下觀察病理組織學(xué)變化并拍攝照片。

1.2.6大鼠滑膜組織的分離 大鼠股動(dòng)脈取血處死后，置于0.1%新潔爾滅溶液浸泡15 min后取出，大鼠平置后，于膝關(guān)節(jié)正中縱向切開皮膚，分離肌肉等組織至可見平滑光亮的滑膜組織，分離滑膜層與纖維層后取出滑膜層組織。采集大鼠雙側(cè)滑膜組織，每只大鼠可取滑膜組織10～15 mg。

1.2.7大鼠滑膜組織總RNA提取和qRT-PCR 各組大鼠隨機(jī)選取滑膜組織約30 mg充分剪碎研磨，提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后按照熒光定量染料SYBR Green試劑盒說明書制備反應(yīng)混合體系，設(shè)置反應(yīng)條件，上機(jī)檢測。實(shí)時(shí)定量PCR引物的基因序列。見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物的基因序列

1.2.8Western blot分析大鼠滑膜組織中GRP78、XBP1、CHOP、TNF-α蛋白的表達(dá) 分別取各組大鼠滑膜組織50 mg于1 ml蛋白裂解液(含有10 μl PMSF)中，置于冰上裂解30 min。離心機(jī)預(yù)冷至4 ℃，裂解后置于離心機(jī)中離心(12 000 r/min，30 min)取上清液。樣本采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量，計(jì)算各組樣本取樣量與蛋白上樣緩沖液混勻后100 ℃加熱10 min。處理后的蛋白樣本采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，TBST清洗3遍每次5 min后，5%脫脂牛奶封閉膜4 h。TBST清洗后，分別與GRP78、XBP1、CHOP、TNF-α和β-actin一抗4 ℃孵育過夜，一抗?jié)舛染鶠? ∶500。TBST清洗3次，每次10 min，用ECL發(fā)光試劑盒顯影，掃描結(jié)果用Image J軟件分析(β-actin作為內(nèi)參)。

表2 CKS對佐劑性大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分的影響±s，n=10)

與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

2 結(jié)果

2.1CKS對AA大鼠繼發(fā)性足腫脹及關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響各組大鼠于左后足注射弗式佐劑致炎后12 d左右出現(xiàn)右側(cè)足爪繼發(fā)性腫脹。 模型組28 d時(shí)足趾腫脹度為(1.25±0.110)Δml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明實(shí)驗(yàn)造模成功；與模型組相比，CKS低劑量組(50 mg/kg)具有一定的抑制作用，足爪腫脹度為(1.06±0.039)Δml，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CKS中劑量(100 mg/kg)和高劑量(200 mg/kg)治療效果較好，足趾腫脹度分別為(0.56±0.078，0.47±0.048)Δml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 模型組28 d時(shí)關(guān)節(jié)炎指數(shù)為(10.860±2.494)；與模型組相比，CKS低劑量組(50 mg/kg)具有一定的抑制作用，關(guān)節(jié)炎指數(shù)為(8.020±2.919)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CKS中劑量(100 mg/kg)、高劑量(200 mg/kg)以及來氟米特組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)分別為(5.356±1.138)、(5.020±1.040)、(4.778±2.132)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此可見，CKS中高劑量組與來氟米特組有較相似的效果，可以明顯降低AA大鼠的足腫脹度。見圖1、表2。

2.2CKS對大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)的影響各組取滑膜組織蘇木精-伊紅染色對比可知：正常組大鼠細(xì)胞排列整齊，踝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，滑膜組織結(jié)構(gòu)無破壞，無血管增生、炎性細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，滑膜組織增生變形、細(xì)胞排列紊亂，存在炎性細(xì)胞浸潤的情況并伴隨滑膜血管翳形成；CKS給藥組病理結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，CKS(50 mg/kg)組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病變等癥狀無明顯改善，CKS(100、200 mg/kg) 組可改善大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨表面破壞情況，并且未出現(xiàn)滑膜細(xì)胞形態(tài)紊亂等癥狀，效果與來氟米特組相似。見圖2。

圖1 CKS對大鼠繼發(fā)性足腫脹的影響±s，n=10)

與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.3CKS對大鼠血清中炎癥因子的影響與正常組相比，模型組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β水平顯著高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，CKS給藥組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平顯著降低，其中CKS(100、200 mg/kg)劑量組效果尤其突出，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

2.4CKS對AA大鼠滑膜組織中GRP78、XBP1、CHOP和TNF-αmRNA表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，在模型組中，GRP78、XBP1、CHOP、TNF-α mRNA的相對表達(dá)量較正常組均顯著提高，分別為正常組的2.37、3.08、1.57和2.90倍。CKS各劑量組經(jīng)給藥治療后比較結(jié)果顯示：CKS(50 mg/kg)劑量組相對于AA大鼠模型組無顯著變化，CKS(100、200 mg/kg)劑量組則不同程度的降低GRP78、XBP1、CHOP、TNF-α mRNA水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖 3。

圖2 CKS對AA大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響 ×100

圖3 CKS對AA大鼠滑膜組織中GRP78、XBP1、CHOP和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

1：正常組；2：模型組；3：CKS(50 mg/kg)組；4：CKS(100 mg/kg)組；5：CKS(200 mg/kg)組；與正常組相比：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.5CKS對AA大鼠滑膜組織中GRP78、XBP1、CHOP和TNF-α蛋白表達(dá)的影響與正常組比較，模型組中 GRP78、XBP1、CHOP、TNF-α蛋白表達(dá)水平均明顯增高(P<0.01)。與模型組相比，給予CKS(100、200 mg/kg)后可以不同程度的降低GRP78、XBP1、CHOP、TNF-α的表達(dá)，而CKS(50 mg/kg)劑量組卻差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可知CKS(100、200 mg/kg)對 GRP78、XBP1、CHOP、TNF-α表達(dá)有抑制作用，且具有劑量依賴性(P<0.05)。見圖4。

表3 CKS對AA大鼠血清中炎癥因子的影響±s，n=10)

與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

RA是一種慢性全身性免疫性疾病，在其發(fā)病過程中主要以關(guān)節(jié)滑膜病變?yōu)樘卣?，表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞異常增生、滑膜炎癥和關(guān)節(jié)滑膜處血管翳的生成等，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟骨的破壞[6]。AA大鼠模型作為典型的免疫性炎癥模型，主要采用以足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑而誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)類似RA的模型[7-8]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇AA大鼠模型代替RA患者，研究CKS對AA大鼠炎癥的保護(hù)作用并深入探討其與ERS之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CKS可以明顯抑制AA大鼠繼發(fā)性足爪腫脹度和降低多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)，同時(shí)關(guān)節(jié)病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)CKS可以減輕大鼠關(guān)節(jié)的滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤和血管翳增加等現(xiàn)象，提示CKS對AA大鼠繼發(fā)性炎癥有明顯的改善作用。

圖4 CKS對AA大鼠滑膜組織中GRP78、XBP1、 CHOP和TNF-α蛋白表達(dá)的影響

1：正常組；2：模型組；3：CKS(50 mg/kg)組；4：CKS(100 mg/kg)組；5：CKS(200 mg/kg)組；與正常組相比：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

TNF-α是一種破壞性促炎性細(xì)胞因子，在RA滑膜炎癥及骨質(zhì)破壞中發(fā)揮著重要作用。研究[9]顯示TNF-α不僅能促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖并表達(dá)金屬蛋白酶破壞軟骨組織，還會(huì)影響 RA 滑膜血管的新生及血管翳的形成。同時(shí)，TNF-α還可以誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞分泌多種炎癥細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6)、環(huán)氧化酶和膠原酶等，因此抑制TNF-α可能是治療 RA的潛在靶點(diǎn)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明了CKS可以有效降低AA大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量，顯著抑制AA大鼠滑膜組織中TNF-α的表達(dá)，提示CKS可能是通過降低促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕AA大鼠關(guān)節(jié)組織的損傷。

現(xiàn)有研究[4]已證實(shí)，在RA的疾病發(fā)展過程中存在著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是維持細(xì)胞正常功能的重要細(xì)胞器，是蛋白質(zhì)合成、修飾、加工并參與代謝以及細(xì)胞信號(hào)處理的場所。未折疊蛋白或錯(cuò)誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)堆積或鈣流失會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。IRE1蛋白是介導(dǎo)ERS的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白之一，在ERS產(chǎn)生的情況下，IRE1與GRP78解離并自身磷酸化被激活，激活的IRE1從XBP1 mRNA上剪接下一段含26個(gè)核苷酸的內(nèi)含子，隨后翻譯編碼為有活性的轉(zhuǎn)錄因子XBP1s并啟動(dòng)IRE1通路[11]。因此GRP78的急速升高也是ERS發(fā)生的標(biāo)志性特征。同時(shí)，促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP在ERS發(fā)生過程中也發(fā)揮著重要的作用，有研究[12-13]顯示IRE1通路可以激活并促進(jìn)CHOP的表達(dá)。Hofmann et al[14]發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中GRP78表達(dá)量明顯升高，下調(diào)GRP78表達(dá)水平后可以看到TNF-α誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞增殖水平也隨之明顯降低。因此，ERS與炎癥信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)以及炎癥因子的釋放密切相關(guān)。本課題研究結(jié)果顯示，與正常組相比，AA模型組中GRP78表達(dá)水平顯著上升，誘導(dǎo)下游IRE1的活化產(chǎn)生大量的XBP1，并導(dǎo)致CHOP表達(dá)升高，最終促使TNF-α的分泌和表達(dá)均增高。當(dāng)給予CKS處理后，顯示CKS中高劑量組則能夠明顯下調(diào)GRP78、CHOP和XBP1 mRNA和蛋白表達(dá)，降低TNF-α的表達(dá)水平。該結(jié)果提示CKS對弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型的緩解作用可能與抑制GRP78/XBP1/CHOP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

綜上所述，本課題顯示AA大鼠的發(fā)病過程中發(fā)生了一系列的改變引起ERS，從而能影響GRP78的表達(dá)，繼而誘導(dǎo)XBP1/CHOP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異?；罨鸹そM織中炎癥因子的釋放，而CKS可以下調(diào)GRP78/XBP1/CHOP信號(hào)通路控制炎癥的產(chǎn)生。該研究結(jié)果提示CKS對弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型有顯著的抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌以及抑制ERS 信號(hào)通路密切相關(guān)。

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