ADMA在交感神經(jīng)損毀自發(fā)性高血壓大鼠中的作用

肖 冰，楊秀春，魯靜朝，王夢肖，陳會強，李 玥，郝 杰，靳雅瓊，劉 凡

不對稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是內(nèi)源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制物之一，能通過抑制一氧化氮(nitric oxide，NO)生成、增加內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附、干擾酶活性等多種機制損傷內(nèi)皮細(xì)胞，從而引起高血壓、冠心病等心血管事件的發(fā)生，是獨立的心血管疾病的危險因子[1-2]。

2010年，Sonmez et al[3]對30例原發(fā)性高血壓患者和30例健康對照人群進行的研究結(jié)果表明，ADMA水平與收縮壓 (systolic blood pressure，SBP)呈正相關(guān)性。2015年，有學(xué)者報道難治性高血壓患者在腎交感神經(jīng)射頻消融術(shù)后，交感神經(jīng)活性與兩個主要的內(nèi)皮甲基精氨酸，ADMA和對稱二甲基精氨酸(symmetric dimethylarginine，SDMA)明顯相關(guān)[4]。眾所周知，NO在維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓方面發(fā)揮重要作用[5]，且交感神經(jīng)系統(tǒng)在原發(fā)性高血壓發(fā)病機制中扮演著重要作用[6]，然而，交感神經(jīng)系統(tǒng)在ADMA中的作用仍然未知。因此，該研究以自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)為研究對象，觀察交感神經(jīng)損毀對SHR大鼠血壓的影響以及心臟、腎臟及血管中精氨酸(L-Arginine，L-Arg)、ADMA、SDMA、NO及NOS的變化，以期探討原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器硫酸胍乙啶、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、ADMA、SDMA(美國Sigma公司)；LC2010-AHT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)(西班牙Panlab NIBP System公司)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)。

1.2化學(xué)交感神經(jīng)切斷術(shù)新生SHR從出生后第7天開始皮下注射硫酸胍乙啶(50 mg/kg)，連續(xù)21 d。對照組皮下注射0.9%生理鹽水[7-8]。

1.3實驗動物健康新生雄性SHR大鼠隨機分組確定為對照組和交感神經(jīng)損毀組，每組5只，分別按上述方法注射0.9%生理鹽水或硫酸胍乙啶。3周后斷乳，給予自由飲食，分籠飼養(yǎng)，明暗周期為12 ∶12，環(huán)境溫度為24 ℃，待12周齡時將兩組SHR大鼠置于24 ℃的代謝籠中收集尿液。

1.4尿NE排泄量測定采用代謝籠法收集每只大鼠常溫下尿液，6 h后取出尿液，測量尿量，4 ℃、18 000 r/min離心5 min，吸取上清液1.5 ml，置于4 ℃冰箱中備用。采用高效液相色譜儀檢測尿液中NE含量。

1.5大鼠尾動脈無創(chuàng)性血壓監(jiān)測在常溫和冷應(yīng)激下，分別使用Panlab NIBP System無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)監(jiān)測大鼠SBP和舒張壓 (diastolic blood pressure，DBP)，每只大鼠測量5次，每次間隔3 min，取其平均值作為該大鼠的血壓水平。

1.6大鼠組織NE、L-Arg、ADMA及SDMA含量測定12周齡時，分別取對照組和交感神經(jīng)損毀組SHR大鼠腎臟，心臟及主動脈組織，稱重后加入HClO4，放入玻璃勻漿管內(nèi)，冰浴下勻漿，用微型旋渦混合儀混合2 min。將勻漿液收集于離心管中．4 ℃下15 000 r/min離心20 min，取上清液于4 ℃下15 000 r/min離心20 min，取上清液，置于-80 ℃低溫凍存保持。采用高效液相色譜儀檢測SHR大鼠腎臟，心臟及主動脈組織組織中NE、Arginine、ADMA和SDMA含量。

1.7腎臟NO含量和NOS活性的測定切取腎臟剝離被膜后置于冰冷的生理鹽水中，剪成小碎塊，用生理鹽水冰浴下制成組織勻漿后測定NO含量及NOS活性，酶的活性采用比色法測定。

2 結(jié)果

2.1化學(xué)交感神經(jīng)切斷術(shù)損毀交感神經(jīng)的效果常溫下，與對照組相比，交感神經(jīng)損毀組SHR大鼠尿NE排泄量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.67，P<0.01，見圖1A)；與對照組相比，交感神經(jīng)損毀組SHR大鼠腎臟、心臟及主動脈NE含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.32、14.71、5.93，P< 0.01，見圖1B)。結(jié)果提示交感神經(jīng)功能明顯受損。

2.2兩組SHR大鼠SBP和DBP的比較對照組SHR大鼠SBP為(24.1±0.7)kPa、DBP為(19.8±0.7)kPa，交感神經(jīng)損毀組SHR大鼠SBP為(21.4±0.8)kPa、DBP為(16.6±0.4)kPa，兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.76、9.02，P<0.01)。見圖2。

2.3兩組SHR大鼠L-Arg、ADMA和SDMA水平的變化與對照組SHR大鼠比較，交感神經(jīng)損毀組SHR大鼠腎臟ADMA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.23，P<0.01，見圖3A)；然而，兩組SHR大鼠心臟和主動脈ADMA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組SHR大鼠比較，交感神經(jīng)損毀組SHR大鼠腎臟、心臟及主動脈SDMA、L-Arg含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B、C)。

2.4兩組SHR大鼠腎臟NO含量和NOS活性交感神經(jīng)損毀組SHR大鼠和對照組SHR大鼠比較，腎臟NO含量(2.48±0.34vs1.64±0.23)μmol/g.prot及NOS活性(0.84±0.20vs0.49±0.16)U/mg.prot顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.58、3.06，P<0.05，P<0.01)。

圖1 常溫下兩組SHR大鼠尿及組織去甲腎上腺素情況

A：6 h尿NE排泄量；B：腎臟 、心臟及主動脈去甲腎上腺素含量；與對照組比較：*P<0.01

圖2 常溫下兩組SHR大鼠收縮壓及舒張壓情況

3 討論

原發(fā)性高血壓為多基因遺傳疾病，其發(fā)病涉及多個機制，其中交感神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)皮功能障礙是其中重要的兩種[9]。交感神經(jīng)系統(tǒng)是內(nèi)皮功能的基本調(diào)節(jié)因子，其功能障礙可能影響NO的合成，而NO在維持血管張力和調(diào)節(jié)血壓方面起到重要作用。ADMA是內(nèi)源性NOS抑制劑，能通過競爭性結(jié)合NOS的活化部位影響NO的生成，引起內(nèi)皮功能障礙。但是，ADMA與交感神經(jīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系仍然未知。

圖3 常溫下兩組SHR大鼠ADMA、SDMA和L-Arg水平情況

A：腎臟、心臟及主動脈ADMA含量；B：腎臟 、心臟及主動脈SDMA含量；C：腎臟 、心臟及主動脈L-Arg含量；與對照組比較：*P<0.01

實驗結(jié)果表明交感神經(jīng)損毀SHR大鼠腎臟NE含量明顯低于對照組，而腎臟ADMA含量明顯高于對照組；與此同時，交感神經(jīng)損毀SHR大鼠心臟及主動脈NE含量明顯低于對照組，而心臟及主動脈ADMA含量卻未見明顯異常，表明交感神經(jīng)系統(tǒng)對ADMA的作用主要體現(xiàn)在腎臟。交感神經(jīng)損毀組SHR大鼠腎臟NO含量及NOS活性較對照組SHR大鼠明顯增加，而SBP和DBP明顯降低，表明交感神經(jīng)活性降低可能引起ADMA釋放減少，NOS活性增加，NO合成升高，從而影響血壓。但是，根據(jù)目前的研究，ADMA與交感神經(jīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系(例如：ADMA可能導(dǎo)致交感神經(jīng)活性增高或交感神經(jīng)活性增高可能導(dǎo)致ADMA增高)依然尚不清楚。首先，交感神經(jīng)活性增高可能引起ADMA釋放增加。Hijmering et al[10]研究報道，在健康人中，交感神經(jīng)激活明顯降低血管內(nèi)皮依賴性血管舒張。其次，ADMA可通過抑制NOS使NO合成減少可能導(dǎo)致NE釋放增加，引起交感神經(jīng)活性增高。Schwarz et al[11]研究發(fā)現(xiàn)，NO抑制大鼠心臟交感神經(jīng)末梢NE釋放。Costa et al[12]報道了單甲基精氨酸抑制NO合成引起人骨骼肌NE釋放增加。因此，ADMA和交感神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)機制不一定是排他性的。

ADMA是在蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferases，PRMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，使蛋白質(zhì)多肽鏈中的L-精氨酸殘基甲基化水解釋放而來，包括ADMA和SDMA，PRMT1催化生成ADMA，而PRMT2催化生成SDMA[13]。大部分的SDMA經(jīng)腎臟排出體外，而ADMA只有少部分通過腎臟排出。80%的ADMA在甲基精氨酸二甲胺水解酶和丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶2的作用下代謝[4,14]。交感神經(jīng)損毀SHR中ADMA升高，究竟是PRMT1表達增強或是甲基精氨酸二甲胺水解酶和丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶2表達降低或是腎臟肌酐清除率降低所致，這些都是值得進一步探討的問題。

Speer et al[15]報道了SDMA可能通過調(diào)節(jié)高密度脂蛋白膽固醇分子等多種機制干擾內(nèi)皮功能，且SDMA可能與交感神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)，所以實驗中觀察了SDMA與交感神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系，結(jié)果提示與對照組SHR大鼠比較，交感神經(jīng)損毀組SHR大鼠腎臟、心臟及主動脈SDMA含量均未見明顯差異。

綜上所述，通過化學(xué)交感神經(jīng)切斷術(shù)損毀交感神經(jīng)，SHR大鼠腎臟ADMA含量明顯降低，NOS活性及NO含量明顯增加，血壓明顯增加，表明交感神經(jīng)系統(tǒng)可能通過調(diào)控ADMA影響血壓，但交感神經(jīng)系統(tǒng)與ADMA之間的作用機制尚不清楚，仍需進一步研究。

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