泛素特異性蛋白酶2a的原核表達(dá)純化及酶活性分析

張萬方，孫寅瑋，王孟慧，黃向瑜，樊松樂，徐 磊

USP2是一種去泛素化酶(deubiquitylating enzymes，DUB)，位于11號(hào)染色體上(11q23.3)[1]。泛素化是蛋白質(zhì)降解的一種重要方式[2]。DUB的作用主要是將泛素從目的蛋白上去掉，是維護(hù)機(jī)體泛素水平的一個(gè)重要機(jī)制[3]，USP2基因經(jīng)過5′末端的選擇性剪切可產(chǎn)生USP2a和USP2b兩個(gè)亞型。研究[4]表明USP2a與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，沉默USP2a能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如在前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌中USP2a能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲[5-7]，抑制USP2a則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。另外，USP2a能穩(wěn)定CyclinD1[9]，參與細(xì)胞周期調(diào)控等。因此推測(cè)USP2a可能一種新的腫瘤標(biāo)志基因[10]。該研究通過表達(dá)USP2a C末端重組蛋白，檢測(cè)重組USP2a蛋白的酶活性，并通過LC-MS/MS檢測(cè)USP2a對(duì)不同性質(zhì)底物的酶活性情況，為進(jìn)一步分析USP2a的催化機(jī)制，開發(fā)USP2a的功能型抑制劑提供重要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1引物設(shè)計(jì)與合成以USP2a cDNA為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增其C末端結(jié)構(gòu)域的特異引物，USP2a-1 F:5′-GGAATTCATGAATTCTAAGAGTGCCCAGG-3′(含有EcoR I酶切位點(diǎn))，USP2a-1 R：5′-CCGCTCGAGCTACATTCGGGAGGG-3′(含有Xho I酶切位點(diǎn))，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2目的片段的擴(kuò)增與表達(dá)載體的構(gòu)建采用25 μl PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃、8 min。產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)并回收目的片段。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃、 8 min。產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)并回收目的片段。

1.3pET28-USP2a-C的表達(dá)與純化取單克隆菌落，接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。第2天擴(kuò)大培養(yǎng)到100 ml含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，采用30 ℃、180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)；檢測(cè)OD=0.6～0.8時(shí)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，IPTG濃度為0.8 mmol/L，誘導(dǎo)4 h后收集菌液；超聲裂解后，分別收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。使用組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，依照說明書進(jìn)行蛋白純化。

1.4重組蛋白USP2a-C的酶活性分析使用SPEX Fluorolog-2 spectrofluorometer (激發(fā)光波長 λ, 380 nmol/L; 發(fā)射光波長 λ, 440 nmol/L) 檢測(cè)系統(tǒng)，分析重組蛋白的酶活性。根據(jù)米氏方程v=(Vmax×[S])/([S]+Km)，對(duì)底物Ub-AMC進(jìn)行梯度稀釋，分別測(cè)出每個(gè)濃度梯度的反應(yīng)初始速率(v)，以v對(duì)底物濃度[S]作圖，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。

1.5LC-MS/MS分析蛋白USP2a-C的酶活性選取底物Ub-V77(肽鍵)和Di-Ub(異肽鍵)分別和USP2a-C進(jìn)行反應(yīng)，并分別在0、15、30、60、120 min時(shí)加入終止緩沖液(水 ∶乙腈 ∶乙酸=80 ∶20 ∶1)終止反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果在Agilent 1200 HPLC和Agilent Q6410上進(jìn)行檢測(cè)[11]，采用Mass Hunter workstation software進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到USP2a-C降解Ub-V77和Di-Ub的反應(yīng)曲線圖。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由于USP2a-C蛋白催化分解底物的降解過程符合非線性關(guān)系，因此采用R Core Team，2015統(tǒng)計(jì)軟件，R語言中的nls函數(shù)進(jìn)行非線性擬合，兩條非線性關(guān)系的顯著性檢驗(yàn)采用Chen et al[12]提出的殘差平方和的F檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1USP2a的克隆以USP2a cDNA為模板，PCR擴(kuò)增USP2a C末端催化結(jié)構(gòu)域基因片段，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1 000 bp左右處有特異性條帶，大小與預(yù)期相符。

連接載體pET28a(+)，挑取單菌落經(jīng)菌液PCR檢測(cè)和雙酶切鑒定，結(jié)果均能得到與預(yù)期大小一致的DNA條帶，見圖1。經(jīng)過DNA測(cè)序證實(shí)USP2a C末端基因序列克隆成功，測(cè)序結(jié)果見圖2～5。

圖1 重組質(zhì)粒pET28-USP2a-C的鑒定

A：PCR電泳圖；M：DNA Marker；1：USP2a-C；2：無模板空白對(duì)照；B：雙酶切電泳圖；3：重組質(zhì)粒pET28-USP2a-C；4：空質(zhì)粒pET28a

圖2 USP2a-C正向測(cè)序結(jié)果

圖3 USP2a-C正向測(cè)序結(jié)果BLAST對(duì)比結(jié)果

圖4 USP2a-C反向測(cè)序結(jié)果

圖5 USP2a-C反向測(cè)序結(jié)果BLAST對(duì)比結(jié)果

2.2USP2a-C的表達(dá)與純化將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28-USP2a-C進(jìn)行表達(dá)與純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，上清液中含有大量的目的蛋白，分子量41 ku，與預(yù)期大小相同，證明USP2a-C以可溶性蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。確定表達(dá)條件后，大量表達(dá)純化USP2a-C蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA柱層析純化目的蛋白，收集樣品，得到純化的USP2a-C蛋白，見圖6 。

純化后SDS-PAGE電泳圖上只有目的蛋白一條帶，說明USP2a-C蛋白純化程度很高。使用LC-MS/MS分析純化的USP2a-C蛋白的純度和分子量。分析得到單一的主峰，檢測(cè)的分子量大小為41 361.8 ku與理論值(41 362.1 ku)一致，證明所純化得到的是USP2a-C目的蛋白，見圖7。

2.3USP2a-C蛋白的酶動(dòng)力學(xué)分析根據(jù)米氏方程v=(Vmax×[S])/([S]+Km)，得到USP2a-C分解Ub-AMC的最大反應(yīng)速率Vmax=6.579 40×10-10mol/(L·s)，米氏常數(shù)Km=1.085 68×10-6mol/L，催化常數(shù)Kcat=2.74×10-11/s，催化效率Kcat/Km=2.53×105mol/(L·s)。證實(shí)純化的USP2a-C蛋白具有良好的催化活性，見圖8。

圖6 重組USP2a-C蛋白電泳圖

A：重組USP2a-C蛋白誘導(dǎo)表達(dá)圖；M： Marker(ku)；1：空白對(duì)照；2：全菌液；3：超聲裂解后的上清液；4：超聲裂解后的沉淀；B：重組USP2a-C蛋白純化電泳圖；5～8：洗滌穿出液；9：Ni-NTA珠子；10～11：純化后的目的蛋白

2.4LC-MS/MS分析USP2a-C蛋白酶分解不同底物的酶活性分別選取了雙泛素Di-Ub(UbK48C-UbD77)和泛素的衍生物Ub-V77作為底物。其中Di-Ub中兩個(gè)乏素之間是正常的異肽鍵結(jié)構(gòu)；底物Ub-V77的Ub和氨基酸殘疾V77之間是由肽鍵相連接。

從圖9可知，反應(yīng)在加入酶后立即開始， 15 min時(shí)底物的Di-Ub被分解了45.83%，Ub-V77被分解了55.35%， 60 min時(shí)，底物Ub-V77的分解率已達(dá)到96.35%，Ub-V77的分解率也已達(dá)到90%左右，120 min時(shí)兩個(gè)反應(yīng)均已檢測(cè)不到底物，反應(yīng)結(jié)束。由此可以證明純化的USP2a-C蛋白具有完好的半胱氨酸蛋白酶活性，能有效地催化分解異肽鍵和肽鍵底物。

圖7 LC-MS/MS分析純化的USP2a-C的蛋白性質(zhì)

A：USP2a-C催化水解梯度稀釋的Ub-AMC產(chǎn)物AMC的吸收值隨時(shí)間的變化圖；B：不同濃度梯度的Ub-AMC反應(yīng)初速度對(duì)底物濃度的關(guān)系圖

圖9 USP2a-C分解Di-Ub和Ub-V77的活性分析圖

a：Di-Ub；b：UbK48C；c：Ub-wt+Ub-D77；d：Ub-wt；e：Ub-V77；f：Ub-V77-SO2

2.5USP2a-C分解Di-Ub和Ub-V77酶活性的統(tǒng)計(jì)分析經(jīng)過非線性擬合統(tǒng)計(jì)分析，顯示USP2a-C分解Di-Ub和Ub-V77兩種不同性質(zhì)底物的反應(yīng)進(jìn)程的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明表達(dá)純化的USP2a-C蛋白半胱氨酸蛋白酶活性正常。見圖10。

圖10 USP2a-C催化分解底物的非線性擬合圖

3 討論

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此本研究選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。以USP2a cDNA為模板，用PCR法克隆了USP2a C末端催化結(jié)構(gòu)域基因片段，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET28-USP2a-C，并獲得了可溶性表達(dá)的USP2a-C蛋白。為了檢測(cè)獲得的USP2a C末端片段的酶活性，本研究選用了DUB通用底物Ub-AMC檢測(cè)酶的活性，結(jié)果證明重組蛋白具有很高的酶活性，并且酶活性穩(wěn)定，室溫放置3 h后酶活性依然不受影響。根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)原理，測(cè)定出了USP2a-C蛋白的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(米氏常數(shù)Km 、催化常數(shù)Kcat 以及催化效率Kcat/Km)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致。

真核蛋白通過大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)多以包涵體的形式產(chǎn)生，通常沒有活性，需要通過體外復(fù)性使蛋白得以活化，復(fù)性過程對(duì)酶的量以及活性造成一定的損失，得到活性酶產(chǎn)量很少。因此對(duì)于原核表達(dá)的重組蛋白酶，獲得可溶性表達(dá)就顯得至關(guān)重要，本研究為了得到可溶性表達(dá)的USP2a-C重組蛋白，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過20、25、30、37、42 ℃等一系列溫度的實(shí)驗(yàn)，顯示在30 ℃條件下,誘導(dǎo)4 h可產(chǎn)生大量的可溶性表達(dá)的蛋白。

為了檢測(cè)表達(dá)的USP2a-C蛋白的半胱氨酸蛋白酶功能是否完整，本研究選用了兩種不同性質(zhì)的底物Di-Ub和Ub-V77進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。他們都不含熒光因子，不能通過熒光檢測(cè)分析酶活性，通常對(duì)于沒有熒光物質(zhì)的底物在檢測(cè)酶活性時(shí)多使用SDS-PAGE的方法[13]。SDS-PAGE檢測(cè)方法通常是將反應(yīng)體系配好后，按照反應(yīng)條件的要求進(jìn)行反應(yīng)，等反應(yīng)完成后，將整個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過電泳條帶的深淺以及有無判斷酶活性變化。但是SDS-PAGE不靈敏，而且只能觀察反應(yīng)系統(tǒng)中底物或產(chǎn)物物質(zhì)的量的最終變化結(jié)果，不能準(zhǔn)確地對(duì)反應(yīng)過程以及產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。本研究采用LC-MS/MS方法，不但能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)程情況，而且能對(duì)反應(yīng)過程中底物或產(chǎn)物的變化進(jìn)行定量檢測(cè)和定性測(cè)定。通過對(duì)LC-MS/MS檢測(cè)的USP2a-C降解兩種不同性質(zhì)底物的反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行非線性擬合統(tǒng)計(jì)分析后顯示，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明表達(dá)純化的USP2a-C蛋白半胱氨酸蛋白酶具有完整的酶活性。

大量的研究[14-18]表明USP2a與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要關(guān)系，目前推測(cè)USP2a是一種新的腫瘤標(biāo)志物。因此研究USP2a的活性功能以及底物特異性將對(duì)腫瘤的檢測(cè)與治療提供重要的理論依據(jù)。下一步將對(duì)USP2a的催化機(jī)制以及在細(xì)胞中的活性機(jī)制開展進(jìn)一步的研究。

總之，本研究獲得了USP2a的可溶性表達(dá)并初步分析了USP2a活性情況，為今后研究USP2a催化機(jī)制以及開發(fā)USP2a抑制劑提供了重要基礎(chǔ)，對(duì)腫瘤的診斷和新藥的開發(fā)具有重要意義。

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