鯛魚鱗多肽-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備、結(jié)構(gòu)與功能

方 菲，陳惠敏，汪少蕓*

魚類為人類提供了豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白[1]，但是在加工過程中會(huì)產(chǎn)生內(nèi)臟、魚皮、魚鱗等廢棄物，丟棄不僅浪費(fèi)資源還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。酶法水解作為蛋白回收的方法，被用于藍(lán)鰭鮪頭[2]、沙丁魚內(nèi)臟[3]，金槍魚魚骨[4]等魚類加工廢棄物中蛋白及多肽的制備。

美拉德反應(yīng)是發(fā)生在蛋白質(zhì)或多肽中游離氨基與還原糖羰基之間的反應(yīng)，可有效提高蛋白、多肽的生物活性，Zeng Yan等[5]將金槍魚魚骨酶法水解物與不同己酮糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)后，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活力大幅度提升，You Juan等[6]研究表明鰱魚蛋白酶解物經(jīng)美拉德反應(yīng)后抗氧化活性顯著提高，Yang等[7]研究表明將比目魚副產(chǎn)物蛋白酶解物與核糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)后可提高比目魚蛋白酶解物對(duì)細(xì)胞的抗氧化活性，且呈劑量依賴性，Zha Fengchao等[8]研究報(bào)道，蝦副產(chǎn)物蛋白水解物與葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)HepG2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有較強(qiáng)的抑制作用，且美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)損傷細(xì)胞表現(xiàn)出的抗氧化活性與自由基清除活性緊密相關(guān)。Sun Qian等[9]使用木糖（xylose，Xyl）修飾豬血紅蛋白酶解液，表明其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有很好的自由基清除能力。此外，Yuan Debao[10]、周婭[11]等研究表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)香蕉中多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的酶促氧化褐變具有抑制作用。Brun等[12]研究報(bào)道谷胱甘肽與葡萄糖、果糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有更強(qiáng)的PPO抑制活性，Tan等[13]研究發(fā)現(xiàn)組氨酸-葡萄糖模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物能夠抑制蘋果PPO的活性，而目前關(guān)于鯛魚鱗多肽美拉德反應(yīng)研究鮮見報(bào)道，這為鯛魚鱗蛋白肽美拉德反應(yīng)及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化等活性的研究提供了新思路。

本研究以鯛魚鱗為原料，通過酶解制備多肽，使用Xyl與鯛魚鱗多肽（fish scales peptides，F(xiàn)SP）進(jìn)行美拉德反應(yīng)，并采用熒光光譜等技術(shù)對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，同時(shí)，研究了美拉德反應(yīng)前后多肽抗氧化活性的變化及對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物PPO活性抑制機(jī)制作初步探究，旨在充分利用魚鱗資源、變廢為寶及生產(chǎn)多功能美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)而提高魚鱗多肽的附加值。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鯛魚鱗 福建省莆田匯豐食品有限公司；蘋果永輝超市；Xyl 上海麥克林生化科技有限公司；PPO、鄰苯二酚紫 上海葉源生物科技有限公司；DPPH、2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt radical，ABTS） 美國Sigma公司；2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitro-benzenesulfonicacid，TNBS） 阿拉丁試劑有限公司；吡啶（分析純） 西隴科學(xué)股份有限公司；其他試劑（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QYSW-10A超純水機(jī) 寶爾水處理有限公司；XZ21K高速冷凍離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TH2-82水浴恒溫振蕩搖床 金壇市鴻科儀器廠；FD-1C-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)、F-4600熒光光譜儀日本Hitachi公司；360 Intelligent傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；DYCZ-24DN雙垂直電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 FSP的制備

鯛魚鱗經(jīng)預(yù)處理后，使用堿性蛋白酶（1.1×105U/g）在酶添加量7.0%、50 ℃、pH 7.30條件下反應(yīng)6 h后，滅酶，離心取上清液，凍干，即為FSP。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以DPPH自由基清除率、294 nm波長處的吸光度和420 nm波長處的吸光度為指標(biāo)，分別探究反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、初始pH值、Xyl與FSP質(zhì)量比、Xyl與FSP總質(zhì)量濃度對(duì)美拉德反應(yīng)及DPPH自由基清除率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以DPPH自由基清除率為考察指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取反應(yīng)時(shí)間、Xyl與FSP質(zhì)量比、Xyl與FSP總質(zhì)量濃度、初始pH值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，各因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示，最終優(yōu)化所得產(chǎn)物即鯛魚鱗多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（fish scales peptides-Maillard reaction products，F(xiàn)SP-MRPs）。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface design

1.3.4 FSP-MRPs結(jié)構(gòu)測定

1.3.4.1 熒光光譜分析

將FSP、FSP-MRPs、Xyl配成溶液，進(jìn)行熒光光譜分析，參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長347 nm，發(fā)射波長掃描范圍300～700 nm，發(fā)射光與激發(fā)光縫寬10 nm，靈敏度2。

1.3.4.2 紅外光譜分析

將FSP、FSP-MRPs、Xyl經(jīng)溴化鉀壓片后進(jìn)行紅外光譜儀分析。儀器參數(shù)：掃描范圍400～4 000 cm－1，儀器分辨率4 cm－1，掃描次數(shù)64。

1.3.4.3 游離氨基及接枝度測定

FSP、FSP-MRPs游離氨基含量及FSP-MRPs接枝度（grafting degree，DG）的測定，參照文獻(xiàn)[14-15]方法，稍加改進(jìn)。取0.25 mL濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的L-Leu溶液分別與2 mL PBS緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 8.20）混勻，之后加入2 mL 0.1% TNBS溶液，于50 ℃避光反應(yīng)1 h，之后加4 mL 0.1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，冷卻后于340 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用FSP、FSP-MRPs替代L-Leu溶液，將所得吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得游離氨基的含量（以L-Leu計(jì)）。DG按公式（1）計(jì)算：

式中：A0為反應(yīng)前樣品的吸光度；A1為反應(yīng)后樣品的吸光度。

1.3.4.4 電泳分析測定

采用N-三（羥甲基）甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（N-3(hydroxymethyl) methylglycinedodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）方法，并采用12.5% Tris-HCl凝膠對(duì)魚鱗明膠、FSP、FSP-MRPs進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后使用過碘酸Schiff堿進(jìn)行染色分析[16-17]。

1.3.5 FSP-MRPs抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除活性

FSP、FSP與Xyl混合物（FSP-Xyl）及FSP-MRPs DPPH自由基清除活性的測定參照Wu Hanchun等[18]的方法。不同濃度樣品與0.1 mmol/L DPPH溶液（95%乙醇溶解）等體積混勻，避光反應(yīng)0.5 h后，于517 nm波長處測定吸光度；將95%乙醇溶液代替DPPH溶液作為參比組；空白組為DPPH與95%乙醇溶液等體積混合。樣品DPPH自由基清除率計(jì)算如公式（2）：

式中：Ai為樣品組吸光度；Aj為參比組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.5.2 ABTS＋·清除活性

FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs ABTS＋·清除活力的測定參照Wang Bin等[19]的方法。臨用前將7 mmol/L ABTS貯存母液與2.45 mmol/L K2S2O8溶液等體積混合，暗處放置16 h，之后用5 mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖液稀釋至734 nm波長處吸光度為0.70±0.02，即ABTS溶液。ABTS溶液與不同濃度的樣品等體積混合，室溫下反應(yīng)10 min，測定734 nm波長處的吸光度，用蒸餾水代替樣品為空白組，用PBS緩沖液（5 mmol/L、pH 7.4）調(diào)零。樣品ABTS＋·清除率計(jì)算如公式（3）：

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.3.5.3 羥自由基清除活性

FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs羥自由基清除活性的測定參照Zhang Yufeng等[20]的方法。1 mL樣品與0.3 mL 8 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 3 mmol/L水楊酸以0.25 mL 20 mmol/L H2O2溶液混勻，于37 ℃保溫0.5 h后，流水冷卻，加入0.45 mL蒸餾水，3 000×g離心10 min，測定510 nm波長處的吸光度，將蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。羥自由基清除率按照公式（4）進(jìn)行計(jì)算：

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.3.5.4 還原力

FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs還原力的測定參照Gülcin等[21]的方法。1 mL樣品與2.5 mL PBS緩沖液（0.2 mol/L、pH 6.6）、2.5 mL 1% K3(Fe(CN)6)溶液混合，于50 ℃保溫20 min，之后加入2.5 mL 10% TCA溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL加入2.5 mL蒸餾水及0.5 mL 1% FeCl3溶液，室溫靜置10 min后，測定700 nm波長處的吸光度?？瞻捉M用1 mL蒸餾水代替樣品。

1.3.6 FSP-MRPs PPO抑制活性與機(jī)制分析

1.3.6.1 PPO抑制活性測定

FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs對(duì)PPO活性的抑制參照Benjamin等[22]的方法并稍加改進(jìn)，取1.5 mL PBS緩沖液（0.2 mol/L、pH 6.8）于30 ℃保溫10 min，加入0.5 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液，0.5 mL PPO，混勻后測定420 nm波長處的吸光度。以PPO加入后開始計(jì)時(shí)，每10 s記錄一次吸光度，以最初直線部分斜率計(jì)算酶活力。一個(gè)酶活力單位定義為：在測定條件下，每分鐘吸光度變化0.001所需的酶量。以PBS緩沖液條件下測得的酶活力為100%，其他緩沖溶液條件下的為相對(duì)殘余活力。酶活力按照公式（5）計(jì)算：

式中：Vr為加緩沖液后總體積/mL；Vs為PPO取用體積/mL；t為反應(yīng)時(shí)間/min；ΔA為吸光度變化值。

1.3.6.2 蘋果切片褐變測試

將蘋果切片后，于質(zhì)量濃度為1.0、3.0、5.0、10.0 mg/mL的FSP-MRPs樣品溶液中浸沒1 min，分別于0.5、1、1.5、2、3、5 h時(shí)視覺觀察色澤變化并拍攝記錄。

1.3.6.3 Cu2＋螯合能力測定

FSP-MRPs Cu2＋螯合能力測定，參照文獻(xiàn)[23]的方法，并稍加改進(jìn)。將1 mL CuSO4溶液（2 mmol/L）與1 mL吡啶振蕩混勻后，加入0.1 mL 0.1%的鄰苯二酚紫溶液，隨后取1 mL FSP-MRPs樣品溶液，加入上述混合溶液中，充分混勻，室溫靜置10 min，測定632 nm波長處的吸光度，記為AS。以去離子水代替FSP-MRPs樣品作為對(duì)照，在相同操作條件下測定其632 nm波長處的吸光度，記為AC，則FSP-MRPs對(duì)Cu2＋螯合能力如公式（6）：

式中：AC為對(duì)照組吸光度；AS為樣品組吸光度。

1.3.6.4 FSP-MRPs Cu2＋熒光分析

在3 mL FSP-MRPs溶液中分別加入0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μmol Cu2＋進(jìn)行熒光光譜分析。

1.3.6.5 不同濃度Cu2＋對(duì)FSP-MRPs抗氧化活性影響

將FSP-MRPs溶于不同濃度的Cu2＋溶液中，測定FSPMRP抗氧化活性的變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Office 2007、Design-Expert 8.0.6、SPSS、Origin 8.5.1等軟件處理數(shù)據(jù)，各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3 次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，數(shù)值用 ±s表示，以P值小于0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSP-MRPs優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

美拉德反應(yīng)過程中糖的裂解會(huì)形成酮類、醛類等無色非熒光的小分子中間產(chǎn)物，這些物質(zhì)在294 nm波長處有紫外吸收，其高低代表美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物量的多少，而420 nm波長處吸光度可用來表示美拉德反應(yīng)的褐變程度及終產(chǎn)物的形成，各因素對(duì)美拉德反應(yīng)及DPPH自由基清除活性的影響，如圖1所示。

圖1 反應(yīng)時(shí)間（a）、Xyl與FSP質(zhì)量比（b）、Xyl與FSP總質(zhì)量濃度（c）、初始pH值（d）與反應(yīng)溫度（e）對(duì)美拉德反應(yīng)及DPPH自由基清除率的影響Fig. 1 Effects of reaction time (a), mass ratio of Xyl to FSP (b), total concentration of Xyl and FSP (c), initial pH (d) and temperature (e) on DPPH radical scavenging capacity and absorbance (A294nm and A420nm)

由圖1a可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，吸光度與DPPH自由基清除活性逐漸上升，在4.0 h后趨近于平緩；而Xyl與FSP質(zhì)量比對(duì)吸光度與DPPH自由基清除活性的影響均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢（圖1b），在Xyl與FSP質(zhì)量比為1∶1時(shí)DPPH自由基清除率最大；隨著Xyl與FSP總質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率與吸光度均增加，在質(zhì)量濃度90 mg/mL時(shí)，趨近于平緩（圖1c）；美拉德反應(yīng)歷程因反應(yīng)pH值不同有所差異，pH值為11、12時(shí)DPPH自由基清除活性與吸光度均大幅度增加（圖1d），表明較高初始pH值條件有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行；由圖1e可知，反應(yīng)溫度為90 ℃時(shí)吸光度與DPPH自由基清除活性影響急劇上升，100 ℃后趨于平緩，表明高溫條件有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析

以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型的方差分析，所得結(jié)果如表3所示，經(jīng)分析得DPPH自由基清除率與反應(yīng)時(shí)間、Xyl與FSP質(zhì)量比、Xyl與FSP總質(zhì)量濃度、初始pH值的四元二次回歸方程為：DPPH自由基清除率/%=68.67＋8.57A＋2.77B＋4.12C＋16.96D＋1.13AB＋1.37AC-1.84AD＋0.97BC－8.09BD＋1.91CD－3.83A2－12.10B2－2.62C2＋3.90D2。由表3可知，此回歸模型P值小于0.000 1，為極顯著，失擬項(xiàng)（P=0.099＞0.05）不顯著，即表明此模型的擬合度較好，且一次項(xiàng)A、C和D，交互項(xiàng)BD、二次項(xiàng)B2對(duì)DPPH自由基清除率的影響極顯著，一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)A2、D2對(duì)DPPH自由基清除率的影響較顯著，二次項(xiàng)C2對(duì)DPPH自由基清除率的影響顯著，表明各因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響不是簡單的線性相關(guān)。

通過回歸模型分析預(yù)測得FSP-MRPs的制備工藝參數(shù)為：反應(yīng)時(shí)間4.05 h、Xyl與FSP質(zhì)量比1.3∶1、Xyl與FSP總質(zhì)量濃度77.19 mg/mL、初始pH 11.85，預(yù)測的DPPH自由基清除率為88.65%。為實(shí)際操作方便將參數(shù)調(diào)整為反應(yīng)時(shí)間4.05 h、Xyl與FSP質(zhì)量比1.3∶1、Xyl與FSP總質(zhì)量濃度78 mg/mL、初始pH 11.85，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，得FSP-MRPs的DPPH自由基清除率為（88.55±1.12）%，與預(yù)測值接近，證明所建立模型的可靠性及響應(yīng)面優(yōu)化對(duì)所制備FSP-MRPs的DPPH自由基清除率的預(yù)測具有可行性。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2 FSP-MRPs結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 熒光光譜分析

圖2 熒光光譜分析圖Fig. 2 Fluorescence spectra

由圖2可知，F(xiàn)SP、FSP-Xyl在347 nm波長處有熒光強(qiáng)度，而FSP經(jīng)美拉德反應(yīng)后347 nm波長處的熒光消失，并伴隨著420～430 nm波長處熒光強(qiáng)度的增加，這與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的多肽-Xyl體系美拉德反應(yīng)的結(jié)果相似，即表明FSP與Xyl發(fā)生美拉德反應(yīng)后，肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并伴隨活性中間體產(chǎn)物形成及醛糖氨基的Strecker降解。

2.2.2 紅外光譜分析

FSP、FSP-MRPs、Xyl紅外光譜分析如圖3所示，Xyl的紅外光譜圖在1 200～760 cm－1處出現(xiàn)很多振動(dòng)吸收峰，即所謂的指紋圖譜區(qū)，這歸因于C—C、C—O鍵的伸縮振動(dòng)以及C—H鍵的彎曲振動(dòng)。與FSP發(fā)生美拉德反應(yīng)后，大部分吸收峰消失，而FSP-MRPs在1 200～1 050 cm－1處的吸收峰增強(qiáng)，表明FSP與Xyl發(fā)生了共價(jià)交聯(lián)。1 420～1 360 cm－1處為C—N鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 690～1 600 cm－1處則為酰胺I帶C＝O鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，3 400 cm－1附近為O—H鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，經(jīng)美拉德反應(yīng)后吸收峰強(qiáng)度變大，與美拉德反應(yīng)過程中Schiff堿（C—N）、吡嗪（C—N）、Amadori重排產(chǎn)物（C＝O）等化合物的形成有關(guān)[25]，并與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的結(jié)果相似，表明FSP與Xyl經(jīng)美拉德反應(yīng)后肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖3 紅外光譜圖Fig. 3 FT-IR spectra

2.2.3 Tricine-SDS-PAGE過碘酸Schiff堿染色

圖4 Tricine-SDS-PAGE圖Fig. 4 Tricine-SDS-PAGE patterns

由圖4可知，在泳道I上，明膠大部分堆積在中間膠上，且表現(xiàn)出較深的洋紅色條帶，這是因?yàn)轸~鱗富含膠原蛋白，而膠原蛋白是糖蛋白且分子質(zhì)量較大，因而其變性形成的明膠可能也含有糖鏈，且分子質(zhì)量較大、分布范圍較廣，因而展現(xiàn)出洋紅色條帶。泳道II上無條帶顯示，這可能是由于明膠經(jīng)酶解后生成了分子質(zhì)量較小的多肽片段，較快穿過凝膠而不被截留。FSP經(jīng)美拉德后，在泳道I、IV上展現(xiàn)出了顏色較淡的洋紅色條帶。此外，F(xiàn)SP經(jīng)美拉德反應(yīng)后游離氨基含量由0.87 mmol/L降低到0.41 mmol/L，這是由Schiff堿及美拉德反應(yīng)高級(jí)階段Heyns化合物降解共同作用的結(jié)果[26-27]。另外，F(xiàn)SPMRPs接枝度為52.97%，綜合表明FSP與Xyl發(fā)生了共價(jià)交聯(lián)，生成了糖肽聚合物，分子質(zhì)量變大。

2.3 抗氧化分析

趙謀明等[28]研究表明草魚肽經(jīng)美拉德反應(yīng)后還原力及羥自由基清除能力加強(qiáng)。FSP、混合物FSP-Xyl、FSPMRPs自由基清除能力及還原力如圖5所示。

圖5 FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs抗氧化活性Fig. 5 Antioxidant activities of FSP, FSP-Xyl and FSP-MRPs

由圖5a可知，F(xiàn)SP的DPPH自由基清除活性較弱，IC50為2.33 mg/mL（數(shù)據(jù)未在圖中體現(xiàn)），經(jīng)美拉德反應(yīng)后DPPH自由基清除活性大大提高（P＜0.05），F(xiàn)SP-MRPs的IC50為125.32 μg/mL，即半數(shù)抑制活性提高了17.59 倍，表明FSP-MRPs可通過提供氫原子方式與DPPH自由基結(jié)合，形成DPPH-H分子[29]，提高DPPH自由基的清除活性。ABTS法檢測物質(zhì)的抗氧化性是通過電子或氫原子轉(zhuǎn)移來還原、猝滅自由基這兩種機(jī)制進(jìn)行的[30]，F(xiàn)SP-MRPs、FSP及FSP-Xyl對(duì)ABTS＋·清除均呈劑量依賴性，F(xiàn)SP經(jīng)美拉德反應(yīng)后，ABTS＋·清除活性提高（P＜0.05），其IC50由100.69 μg/mL降低至33.53 μg/mL，半數(shù)抑制活性為FSP的3.0 倍（圖5b）。此外，F(xiàn)SP經(jīng)美拉德反應(yīng)后，羥自由基清除活性增強(qiáng)，其IC50由4.27 mg/mL降到2.41 mg/mL（圖5c）。這些結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)可提高FSP的自由基清除能力（P＜0.05），F(xiàn)SP-MRPs具有較強(qiáng)自由基清除活性。還原力作為物質(zhì)抗氧化能力的評(píng)價(jià)方法，吸光度越大則抗氧化能力越強(qiáng)，F(xiàn)SP-MRPs的還原力均大于FSP與FSP-Xyl，在1.5 mg/mL時(shí)，F(xiàn)SP-MRP還原力吸光度分別為FSP和FSPXyl的5.58、17.71 倍（圖5d），這是因?yàn)槊览路磻?yīng)初期Amadori降解產(chǎn)物、雜環(huán)類化合物以及類黑精中的吡咯銅和吡啶酮部分的羥基，能夠供體電子阻斷自由基介導(dǎo)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[31]，因而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性，可作為一種還原劑。

2.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物PPO抑制活性與機(jī)制分析

2.4.1 PPO抑制活性

圖6 PPO抑制活性Fig. 6 PPO inhibitory activity of FSP-MRPs

FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs對(duì)PPO抑制活性結(jié)果如圖6所示，F(xiàn)SP-MRPs質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，PPO的相對(duì)殘余活力為41.99%，即表明有58.01%的酶活性受到抑制，而相同質(zhì)量濃度的FSP對(duì)PPO活性的抑制較FSPMRPs低，表明FSP經(jīng)美拉德反應(yīng)后，PPO抑制作用增強(qiáng)，IC50為0.54 mg/mL。Brun等[12]認(rèn)為MRPs具有PPO抑制活性部分歸因于產(chǎn)物的Cu2＋螯合特性，同時(shí)，MRPs可修飾PPO或TYR活性中心附近的組氨酸殘基，影響酶構(gòu)象及結(jié)構(gòu)的完整性，從而變成失活的蛋白，另外，MRPs具有螯合、還原和消除氧的特性。因而，F(xiàn)SPMRPs可能是通過消除活性氧、與PPO活性中心的Cu2＋結(jié)合及修飾活性中心附近的組氨酸殘基，使得PPO部分活性喪失。

2.4.2 蘋果切片褐變結(jié)果

由圖7可知，對(duì)照組在0.5 h內(nèi)發(fā)生急劇褐變，但在隨后褐變時(shí)間內(nèi)，褐變程度增加緩慢，總體上表現(xiàn)為切片表皮顏色暗黃無光澤。而FSP-MRPs處理組中，蘋果切片的色澤保護(hù)程度因FSP-MRPs質(zhì)量濃度不同略有不同，1 mg/mL與3 mg/mL的FSP-MRPs處理組，蘋果切片褐變抑制能力較弱，3 h后褐變較明顯，但顏色仍優(yōu)于對(duì)照組，F(xiàn)SP-MRPs質(zhì)量濃度為5 mg/mL和10 mg/mL時(shí)，蘋果切片保持著一定的亮黃色，褐變程度較微弱，表明FSPMRPs能夠延緩蘋果褐變，也有相關(guān)研究報(bào)道組氨酸-葡萄糖模式美拉德反應(yīng)所得MRPs對(duì)蘋果PPO的活性具有抑制作用且隨加熱時(shí)間延長而增強(qiáng)[13]，此外，Yuan Debao等[10]也表明MRPs能夠降低香蕉切片的酶促氧化褐變，因而，F(xiàn)SP-MRPs延緩蘋果褐變可能是通過降低PPO的酶促氧化，這為果蔬加工護(hù)色研究提供了新的思路。

2.4.3 FSP-MRPs Cu2＋螯合能力分析

Rendleman等[32]表明MRPs是良好的金屬離子螯合劑，可通過釋放2 個(gè)氫原子和消耗氧原子將Cu2＋還原，形成配合物。張曉溪等[33]表明果糖與氨基酸的MRPs具有螯合Cu2＋、Fe2＋的特性。FSP-MRPs對(duì)Cu2＋的螯合特性如圖8所示。

圖8 FSP-MRPs的Cu2＋螯合（a）及熒光光譜分析（b）Fig. 8 Cu2+ chelating activity of FSP-MRPs (a) and fluorescence spectra of FSP-MRPs in the presence of Cu2+ (b)

由圖8a可知，隨著FSP-MRPs質(zhì)量濃度增加，Cu2＋螯合能力增強(qiáng)，表明FSP-MRPs具有Cu2＋螯合能力，這可能是因?yàn)镕SP經(jīng)美拉德反應(yīng)后產(chǎn)生的類黑精、還原酮以及雜環(huán)化合物具有螯合金屬離子的特性。為進(jìn)一步探究FSPMRPs與Cu2＋的相互作用，采用熒光光譜掃描分析以探究其螯合機(jī)制（圖8b），隨著Cu2＋濃度增加，F(xiàn)SP-MRPs熒光強(qiáng)度逐漸降低，從757.625下降到294.926，其中Cu2＋添加量為2 μmol時(shí)，熒光強(qiáng)度降低幅度最明顯，這可能是因?yàn)镃u2＋的加入使得FSP-MRPs發(fā)生折疊和結(jié)構(gòu)的修飾。表明Cu2＋能使FSP-MRPs的熒光發(fā)生猝滅，能夠形成FSPMRPs-Cu螯合物。

2.4.4 螯合位點(diǎn)猜測

表4 不同濃度的Cu2＋對(duì)FSP-MRPs抗氧化活性的影響Table 4 Effect of Cu2+ concentration on the antioxidant activities of FSP-MRPs

由表4可知，在不同濃度的Cu2＋環(huán)境中，F(xiàn)SPMRPs的DPPH自由基、羥自由基和還原力降低顯著（P＜0.05），這與文獻(xiàn)[34-35]報(bào)道的結(jié)果相似，其中，還原力下降幅度最明顯，而DPPH自由基與羥自由基清除能力下降幅度較小，Cu2＋可能是通過與FSP-MRPs中供電子基團(tuán)或供氫體發(fā)生相互作用進(jìn)行螯合，這些螯合位點(diǎn)與表現(xiàn)出自由基清除能力以及還原力的基團(tuán)有關(guān)。

3 結(jié) 論

反應(yīng)時(shí)間、初始pH值、反應(yīng)溫度等因素對(duì)FSP 美拉德反應(yīng)影響顯著。延長反應(yīng)時(shí)間、提高初始pH值及反應(yīng)溫度，有利于美拉德反應(yīng)進(jìn)行及活性中間產(chǎn)物的形成。FSP經(jīng)美拉德反應(yīng)后形成共價(jià)交聯(lián)，肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，生成糖肽聚合物。FSP經(jīng)美拉德反應(yīng)后自由基清除能力及還原力均顯著提高（P＜0.05），具有較強(qiáng)的抗氧化活性，呈劑量依賴性。在反應(yīng)時(shí)間4.05 h、Xyl與FSP質(zhì)量比1.3∶1、Xyl與FSP總質(zhì)量濃度78 mg/mL、初始pH 11.85、反應(yīng)溫度100 ℃條件下所得的FSP-MRPs具有較強(qiáng)的PPO抑制活性，能夠抑制蘋果褐變，可能是由于FSP-MRPs具有Cu2＋螯合特性，螯合位點(diǎn)與抗氧化基團(tuán)有關(guān)。

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