苦馬豆素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87凋亡及HSP90/AKT通路的影響

童軍衛(wèi)，劉補(bǔ)興，胡小銘，李 燁，劉正敏，蔡清風(fēng)*

0 引言

膠質(zhì)瘤(Glioma)是源自神經(jīng)上皮的惡性腫瘤，是顱內(nèi)發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1]。目前，手術(shù)、放療、化療是惡性腫瘤治療的主要手段，然而膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)迅速，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)治療難以切除癌變組織，而且放療和化療藥物毒副作用大，容易產(chǎn)生耐藥性。因此，采用安全有效的藥物治療膠質(zhì)瘤已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)，植物來(lái)源的藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療中。苦馬豆素(Swainsonine，SW)是澳洲學(xué)者Colegate從灰苦馬豆(Swainsonacanescens)分離得到的主要提取成分，苦馬豆素作為抗癌天然小分子藥物，被廣泛應(yīng)用于食道癌、胃癌和肝癌的基礎(chǔ)研究中[2-4]。研究表明，苦馬豆素能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)還能提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抵抗能力[5]。然而苦馬豆素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87凋亡及其相關(guān)作用機(jī)制方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在利用人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87，闡明苦馬豆素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87凋亡及HSP90/AKT通路的影響，以探究苦馬豆素抗腫瘤作用的潛在分子機(jī)制，為膠質(zhì)瘤靶向藥物的開(kāi)發(fā)及臨床治療提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人口膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 苦馬豆素購(gòu)自陜西楊陵大正生物技術(shù)有限公司。RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自NEB公司；鼠抗人caspase 3多克隆抗體、鼠抗人HSP90多克隆抗體和鼠抗人AKT多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；BD-FAC Scan流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；3K15超低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；SW-CJ-2D2G2F2FD雙人凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州蘇凈；引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將購(gòu)買(mǎi)的U87細(xì)胞解凍復(fù)蘇，按1×106/mL接種于DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基中[10%胎牛血清(FBS，Life Technologies)，100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素]，置于37 ℃ 5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。全量更換DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×106/mL接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100 μL/孔)，分別加入苦馬豆素使無(wú)血清培養(yǎng)基中苦馬豆素的含量分別為0、4、8、12 μg/mL，依次命名為對(duì)照組、苦馬豆素低劑量組、苦馬豆素中劑量組、苦馬豆素高劑量組，每組重復(fù)6孔。培養(yǎng)48 h。

1.2.2 U87細(xì)胞形態(tài)變化比較 培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，將各組細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌2～3次后，加入0.125%胰蛋白酶消化2～3 min，加入75%乙醇固定細(xì)胞，置于4 ℃下過(guò)夜，次日棄去乙醇后，用PBS漂洗細(xì)胞2～3次。加入0.5 mL膠質(zhì)纖維酸性蛋白，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2～3次后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞2～3 min，加入75%乙醇于4 ℃下過(guò)夜固定細(xì)胞，用PBS漂洗細(xì)胞，置于超低溫離心機(jī)2 000 r/min離心10 min，棄去上清，此過(guò)程重復(fù)2～3次；加入10 μL RNA酶在37 ℃下孵育30 min，用10 μL PI進(jìn)行染色，然后在黑暗中4 ℃孵育30 min。使用BD-FAC Scan流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。使用ModFit LT軟件進(jìn)行凋亡細(xì)胞百分比計(jì)算。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)caspase 3、HSP90、AKT基因表達(dá)情況 離心收集各組U87細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)呈cDNA。然后根據(jù)NCBI上提交caspase 3、HSP90、AKT的cDNA序列設(shè)計(jì)引物。caspase 3：上游引物F：5′-GGAAGCGAATCAATGGACTC-3′，下游引物R：5′-CTCAGAAGCACACAAACAAAA-3′；HSP90：上游引物F：5′-GGAATTGGAATGACCAAGGC-3′，下游引物R：5′-AGCAGAATGTGACTCGAGCA-3′；AKT：上游引物F：5′-CGGCAGGACCGAGC-3′，下游引物R：5′-TTGAAGAATTTGGAGGGAAGG-3′，進(jìn)行qRT-PCR，同時(shí)以GAPDH為內(nèi)參。PCR的反應(yīng)體系為：5X緩沖液10 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，上游引物F 2 μL，下游引物R 2 μL，10 mmol dNTP mix 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 33 μL；PCR的反應(yīng)條件為：預(yù)變性：95 ℃ 5 min，變性：95 ℃ 30 s，延伸：63 ℃ 15 s(caspase 3、HSP90、AKT和GAPDH)，40個(gè)循環(huán)，延伸時(shí)讀取光密度(D)值。采用最大二階導(dǎo)數(shù)法(2-△△Ct)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。△△Ct=(實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct平均值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct平均值)-(對(duì)照組目的基因Ct平均值-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct平均值)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)caspase 3、HSP90、AKT蛋白表達(dá)情況 培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，按每1×106個(gè)細(xì)胞加入0.5 mL細(xì)胞裂解液[150 mmoL/L NaCl，1.0% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS，50 mmoL/L Tris(pH 8.0)]提取細(xì)胞總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每孔上樣體積20 μL，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50 min，分別滴加鼠抗人caspase 3、HSP90、AKT多克隆抗體，置于4 ℃下過(guò)夜，滴加二抗，37 ℃放置1 h。加入ECL發(fā)光劑進(jìn)行顯影，利用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 U87細(xì)胞形態(tài)變化比較 培養(yǎng)48 h后，對(duì)照組U87細(xì)胞形態(tài)多樣，大小不一，胞體上有突起，向周?chē)由?，且染色質(zhì)均勻分布，結(jié)果見(jiàn)圖1a；苦馬豆素組細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞稀疏生長(zhǎng)，細(xì)胞和細(xì)胞核體積明顯縮小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)固縮，有的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體；且隨著苦馬豆素劑量的增加，U87細(xì)胞形態(tài)變化越明顯，結(jié)果見(jiàn)圖1b～圖1d。

圖1 苦馬豆素對(duì)U87細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87經(jīng)不同濃度苦馬豆素(4、8、12 μg/mL)處理后，苦馬豆素中劑量組和苦馬豆素高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦馬豆素劑量增加，U87細(xì)胞的凋亡率增加，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 苦馬豆素對(duì)U87細(xì)胞凋亡的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與苦馬豆素低劑量組比較，#P<0.05;與苦馬豆素中劑量組比較，△P<0.05

2.3 qRT-PCR檢測(cè)caspase 3、HSP90、AKT基因表達(dá)情況 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87經(jīng)不同濃度苦馬豆素(4、8、12 μg/mL)處理后，苦馬豆素中劑量組和苦馬豆素高劑量組caspase 3 mRNA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦馬豆素劑量增加，caspase 3 mRNA的表達(dá)水平顯著提高，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87經(jīng)不同濃度苦馬豆素(4、8、12 μg/mL)處理后，苦馬豆素中劑量組和苦馬豆素高劑量組HSP90 mRNA、AKT mRNA的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦馬豆素劑量增加，HSP90 mRNA、AKT mRNA的表達(dá)水平顯著降低，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)caspase 3基因表達(dá)情況

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與苦馬豆素低劑量組比較，#P< 0.05;與苦馬豆素中劑量組比較，△P<0.05

圖4 qRT-PCR檢測(cè)HSP90、AKT基因表達(dá)情況

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與苦馬豆素低劑量組比較，#P< 0.05;與苦馬豆素中劑量組比較，△P<0.05

2.4 Western blot檢測(cè)caspase 3、HSP90、AKT蛋白表達(dá)情況 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87經(jīng)不同濃度苦馬豆素(4、8、12 μg/mL)處理后，苦馬豆素中劑量組和苦馬豆素高劑量組caspase 3蛋白的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦馬豆素劑量增加，caspase 3蛋白的表達(dá)水平顯著提高，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)caspase 3蛋白表達(dá)情況

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與苦馬豆素低劑量組比較，#P< 0.05;與苦馬豆素中劑量組比較，△P<0.05

膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87經(jīng)不同濃度苦馬豆素(4、8、12 μg/mL)處理后，苦馬豆素中劑量組和苦馬豆素高劑量組HSP90、AKT蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦馬豆素劑量增加，HSP90、AKT蛋白的表達(dá)水平顯著降低，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)HSP90、AKT蛋白表達(dá)情況

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與苦馬豆素低劑量組比較，#P< 0.05;與苦馬豆素中劑量組比較，△P<0.05

3 討論

苦馬豆素是從植物中提取的一種吲哚里西啶生物堿，具有突出的抗腫瘤作用。研究表明，苦馬豆素通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞表面糖蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[6-7]。Dennis[8]研究表明，苦馬豆素能夠抑制結(jié)腸腫瘤的生長(zhǎng)。Seftor等[9]研究表明，苦馬豆素可以抑制腫瘤細(xì)胞Ⅳ型膠原酶的表達(dá)，阻止腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。吳達(dá)等[10]研究表明，低濃度的苦馬豆素就可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞相關(guān)基因上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，苦馬豆素還可以通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途經(jīng)實(shí)現(xiàn)人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人食道癌Eca-109細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等的凋亡[11]。You等[12]研究表明，苦馬豆素能促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡，de-Freitas-Junior等[13]研究表明，苦馬豆素能促進(jìn)結(jié)腸癌HTC-116細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果證實(shí)，苦馬豆素能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。本研究表明，苦馬豆素會(huì)引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87形態(tài)的變化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且隨著苦馬豆素劑量的增加，U87細(xì)胞的凋亡率顯著增加，與上述研究結(jié)果一致。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵是caspase被激活，當(dāng)caspase的活性受到抑制時(shí)，就會(huì)引起腫瘤的發(fā)生[14-15]。caspase家族有16個(gè)成員，caspase 3是凋亡的主要參與成分。caspase 3能特異性切割DNA，使染色質(zhì)凝聚、核酸酶激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。鄭愛(ài)秋等[16]研究表明，caspase 3在癌組織中通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡而使惡性程度降低；Hay等[17-18]研究表明，重組蛋白IAP可以下調(diào)caspase 3或caspase 7的表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡；然而苦馬豆素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中caspase 3表達(dá)水平的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87經(jīng)苦馬豆素處理后，caspase 3表達(dá)水平升高，且隨著苦馬豆素劑量增加，caspase 3表達(dá)水平顯著提高，呈劑量依賴(lài)性，進(jìn)一步證實(shí)苦馬豆素能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的凋亡。

熱休克蛋白(Heat shock protein 90，HSP90)作為一種分子伴侶能夠參與各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如細(xì)胞生長(zhǎng)、周期調(diào)控和細(xì)胞存活等，并與通路中的關(guān)鍵分子相互作用，通過(guò)與底物蛋白活性部位的結(jié)合，使其維持正常的功能[19]。近年研究表明，運(yùn)用HSP90抑制劑，可以提高細(xì)胞的凋亡率，提示HSP90能夠促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡[20]。絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Serine threonine kinase，AKT)是原癌基因v-Akt的同源物，參與caspase 3的活化[21]。AKT能夠參與許多細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如：PI3K/AKT、DNA-PKcs/Akt、Epac/Akt等，這些信號(hào)通路與細(xì)胞的生長(zhǎng)、細(xì)胞周期以及調(diào)控細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)，且AKT是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白。AKT是HSP90的底物蛋白，研究表明,HSP90能夠與AKT結(jié)合，阻止AKT的去磷酸化，保護(hù)AKT的活性功能不喪失[22]。Shaknovich等[23]研究表明,AKT的活化需要AKT與HSP90及伴侶分子Cdc37組成復(fù)合物，HSP90的伴侶功能對(duì)于維持該復(fù)合體的存在至關(guān)重要。Li等[24]研究表明，HSP90/Akt信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)膿毒癥小鼠心肌細(xì)胞中caspase 3的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡；Gong等[25]研究表明，海兔素通過(guò)抑制HSP90/Akt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白(HSP90和Akt)的表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL26凋亡；Maria等[26]研究表明，用HSP90和Akt抑制劑靶向抑制信號(hào)通路PI3K/Akt/HSP90，可以促進(jìn)人胃癌細(xì)胞凋亡。以上研究均提示，HSP90/Akt信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)HSP90、AKT及HSP90/AKT信號(hào)通路方面均進(jìn)行了初步研究,但是苦馬豆素對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞HSP90/AKT信號(hào)通路的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究表明,苦馬豆素能夠抑制HSP90/AKT信號(hào)通路中HSP90和AKT蛋白的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，且隨著苦馬豆素劑量增加，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87凋亡水平顯著升高，呈劑量依賴(lài)性，推測(cè)苦馬豆素促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87凋亡的機(jī)制是通過(guò)抑制HSP90/AKT信號(hào)通路的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，苦馬豆素能夠抑制HSP90/AKT信號(hào)通路中HSP90和AKT蛋白的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87凋亡，為膠質(zhì)瘤的臨床治療和膠質(zhì)瘤靶向藥物的開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

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