考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定復(fù)方白及乳膏中植物蛋白的含量

陶平德陳芳(通訊作者)雷敏常明泉陳林

（1十堰市太和醫(yī)院 湖北 十堰442008）（2湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院學(xué)生 湖北 十堰442000）

復(fù)方白及乳膏是太和醫(yī)院2013年立項(xiàng)資助的科研項(xiàng)目，也是該院2016年立項(xiàng)的前沿技術(shù)項(xiàng)目。該乳膏以白及溶膠[1]為主藥，加基質(zhì)經(jīng)乳化而成， 具有清除皮膚自由基、軟化角質(zhì)、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗氧化、保濕潤(rùn)膚的功效，用于治療干性皮炎、皮膚皸裂、黃褐斑，也可用于魚鱗病、銀屑病的輔助治療[2-3]。

復(fù)方白及乳膏能使黃褐斑減退并抑制其生長(zhǎng)，可能與其含有一定量的植物蛋白有關(guān)，前期，筆者以白及多糖為指標(biāo)，對(duì)該乳膏的質(zhì)量控制、體外釋放度等內(nèi)容做過(guò)一些相關(guān)研究，為進(jìn)一步明確其活性成份和藥理作用，更好的控制復(fù)方白及乳膏質(zhì)量、為開展后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，作者試驗(yàn)用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)其中的植物蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.儀器及試藥

1.1 儀器

TU-1901型分光光度儀（北京普析通通用儀器有限責(zé)任公司）；BCD-610W型冰箱（博西華家用電器有限公司,功率：1.07KW）；KM-410C型超聲震蕩儀（廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，40KHZ）；WGA-UNI-10型超純水器（北京普析通儀器有限責(zé)任公司，功率：300W）；FA-2004型電子分析天平（上海精密儀器有限公司，精度0.0001g）；MH-1000型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司，300W）；試管架（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司，13×50）；玻璃試管（20mL、10mL）。

1.2 試藥

復(fù)方白及乳膏（太和醫(yī)院生產(chǎn)，批號(hào)：20170322，20170410，20170416）；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)140619-201622,包裝規(guī)格23.5mg/瓶)；考馬斯亮藍(lán)G250（成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司，CBB，批號(hào)6401-58-1）；無(wú)水乙醇（武漢市中天化工有限責(zé)任公司，批號(hào)20161225，分析純）；85%磷酸（武漢市中天化工有限責(zé)任公司，批號(hào)20161212，分析純）；NaCl（沈陽(yáng)試劑廠,批號(hào)2016010599，含量95～100.05%，基準(zhǔn)試劑）；純化水（太和醫(yī)院新鮮生產(chǎn)）。

2.方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

（1）0.15mol·L-1Nacl溶液。精密稱取0.4387gNaCl于50mL容量瓶中，加純化水溶解，定容,即得。（2）考馬斯亮藍(lán)溶液。精密稱取考馬斯亮藍(lán)G-25050mg溶于25mL乙醇中，加入85%磷酸50mL，混合，加純化水稀釋至500mL，即得。（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。精密稱取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置10mL容量瓶中，加純化水溶解，定容，即得1.0mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)照品儲(chǔ)備液，置冰箱中低溫保存（4℃），取該溶液0.2mL于試管中，加0.15mol·L-1Nacl溶液至2.0mL，加入考馬斯亮藍(lán)溶液10.0mL，混勻，在室溫放置5min，即得。（4）供試品溶液。精密稱取復(fù)方白及乳膏0.25g于燒杯中，加無(wú)水乙醇約20mL，超聲溶解，過(guò)濾至50mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇洗滌燒杯3次（每次約8mL），集中濾液，用無(wú)水乙醇定容，取該溶液0.6mL于試管中，加0.15mol·L-1Nacl溶液至2.0mL,加入考馬斯亮藍(lán)溶液10.0mL，混勻，放置5min，即得。（5）空白溶液的制備。精密吸取純化水2mL于試管中，加入考馬斯亮藍(lán)溶液10.0mL混勻，在室溫放置5min，即得。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

分別取“2.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液、供試品溶液和空白樣品溶液，在分光光度儀上于500～700nm波長(zhǎng)處掃描，記錄掃描圖，結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液、供試品溶液均在595nm處均有最大吸收，空白樣品溶液在此波長(zhǎng)處無(wú)吸收，選擇595nm為測(cè)定波長(zhǎng)，掃描圖見圖1。

圖1 紫外掃描圖

2.3 曲線方程的建立

分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下濃度為1.0mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備溶液0.2mL，0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL于10mL試管中，每管加0.15mol·L-1Nacl溶液至1.0mL，混勻，各取0.1mL于對(duì)應(yīng)編號(hào)的新試管中，分別加入考馬斯亮藍(lán)溶液5.0mL混勻，室溫放置5min，即得毎mL含標(biāo)準(zhǔn)蛋白為3.92μg、7.84μg、11.76μg、15.69μg、19.61μg的溶液,取各溶液分別在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸收度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程為y=0.036x-0.0005，r=0.9995,標(biāo)準(zhǔn)蛋白在3.92μg·mL-1～19.61μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在595nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定5次，記錄吸光度值，結(jié)果RSD為0.77%。表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在595nm波長(zhǎng)處分別于0,1,3，6h測(cè)定吸光度，記錄吸光度值，結(jié)果RSD為1.89%，表明標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在6h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

平行精密稱取復(fù)方白及乳膏0.25g于試管中，共5份，按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備樣品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，結(jié)果RSD為1.34%。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)知含量的復(fù)方白及乳膏（批號(hào)20170410）0.125g共9份，毎3份為1組，分別按樣品含量的80%、100%、120%加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方白及乳膏中植物蛋白回收率實(shí)驗(yàn)表（n =9）

2.8 含量測(cè)定

精密稱取復(fù)方白及乳膏0.25g（批號(hào)為20170322，20170410，20170416）于燒杯中，每個(gè)批號(hào)各3份，按“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在分光光度儀上于595nm處分別測(cè)定吸收度，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方白及乳膏中植物蛋白含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3.討論

考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合后呈藍(lán)色，在595nm波長(zhǎng)處有最大吸收,在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)與染色劑的結(jié)合量與測(cè)定波長(zhǎng)的吸光度值成正比，因而采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定復(fù)方白及乳膏中的植物蛋白含量。在制備供試品溶液時(shí)，曾使用純化水、10%NaL溶液、乙醇-氯仿（1:1）混合液做乳膏的溶劑，超聲處理，對(duì)液體分別應(yīng)用離心、過(guò)濾等方法，但效果都不理想，而采用無(wú)水乙醇做溶劑，則溶解效果好，溶解速度快，所制備的溶液澄清，檢出效果良好。作者曾考慮到植物蛋白在酸、堿、丙酮、乙醇中會(huì)受到影響。是否因?yàn)橹参锏鞍妆砻嬗幸粚永w維膜，對(duì)氨基酸結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用？值得進(jìn)一步驗(yàn)證探討。

復(fù)方白及乳膏中的蛋白屬于植物蛋白，成份比較復(fù)雜，里面不僅有多糖、植物蛋白，還有植物色素等物質(zhì)，植物色素可能也產(chǎn)生一定的光密度值，所以在配制樣品時(shí)應(yīng)使蛋白質(zhì)濃度在0.1mg.mL-1以內(nèi)，必要時(shí)適當(dāng)增加考馬斯亮藍(lán)染色液的用量，以保證與蛋白質(zhì)染色反應(yīng)完全，克服其它成份對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定產(chǎn)生的影響。酸堿對(duì)植物蛋白的測(cè)定會(huì)有一定影響，配制檢測(cè)溶液時(shí)加入0.15mol·L-1NaCl溶液稀釋，可緩沖其影響。在測(cè)定實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)把本實(shí)驗(yàn)所用器具用鉻酸鉀清潔液浸泡、用純化水清洗干凈，并避免使用石英吸收池，防止用具不潔對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾，每次測(cè)定完畢用乙醇清洗比色皿，然后用純化水清洗，以免考馬斯亮藍(lán)染色液在比色皿上存在殘留。

【參考文獻(xiàn)】

[1]李玲,常明泉.天然高分子復(fù)方白及乳膏的制備及質(zhì)量控制[J].海峽藥學(xué),2015,27(1):51-53.

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[3]黃漢陵，汪移林，王剛.自制復(fù)方白及乳膏治療Ⅲ型足部皸裂86例療效觀察[J]．山東醫(yī)藥，2014,53（31）：105-106.