CB1受體參與運(yùn)動(dòng)疲勞損害小鼠皮層-紋狀體通路eCB-LTD的調(diào)節(jié)

馬 婧，陳慧敏，劉曉莉，喬德才

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CB1受體參與運(yùn)動(dòng)疲勞損害小鼠皮層-紋狀體通路eCB-LTD的調(diào)節(jié)

馬 婧，陳慧敏，劉曉莉，喬德才

北京師范大學(xué) 體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院，北京 100875

目的：通過研究小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后皮層-紋狀體通路內(nèi)源性大麻素介導(dǎo)的長(zhǎng)時(shí)程抑制（endocannabinoid-mediated long-term depression，eCB-LTD）的變化，揭示運(yùn)動(dòng)疲勞對(duì)小鼠皮層-紋狀體通路突觸可塑性的影響。方法：C57/BL6雄性成年小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control）和運(yùn)動(dòng)疲勞組（exercise-induced fatigue，EF）。利用電動(dòng)跑臺(tái)建立重復(fù)力竭的運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠模型。采用離體腦片場(chǎng)電位記錄技術(shù)，檢測(cè)小鼠皮層-紋狀體通路的LTD，并通過加入大麻素1型（cannabinoid 1，CB1）受體的拮抗劑AM251，鑒定該LTD是否依賴于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，ECS）；采用離體腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，檢測(cè)小鼠紋狀體中型棘狀神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs）的基本電生理特性；采用免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)小鼠紋狀體腦區(qū)CB1受體的蛋白表達(dá)含量。結(jié)果：1）與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠皮層-紋狀體通路的LTD顯著受損（＜0.01），且該LTD能夠被CB1受體拮抗劑AM251阻斷，證實(shí)其為eCB-LTD。2）運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠紋狀體MSNs的基本電生理特性與對(duì)照組小鼠相比無(wú)差異（＞0.05）。3）與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠紋狀體腦區(qū)CB1受體的表達(dá)含量顯著上調(diào)（＜0.01）。結(jié)論：小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后皮層-紋狀體通路的eCB-LTD受損，但是紋狀體MSNs的基本電生理特性不變，CB1受體蛋白表達(dá)含量升高可能是對(duì)eCB-LTD受損的一種代償反應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一次證實(shí)運(yùn)動(dòng)疲勞損害小鼠皮層-紋狀體通路的eCB-LTD，提示皮層-紋狀體通路突觸可塑性異?？赡苁沁\(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生或維持的機(jī)制之一。

運(yùn)動(dòng)疲勞；皮層-紋狀體通路；大麻素系統(tǒng)；長(zhǎng)時(shí)程抑制；大麻素1型受體

前言

運(yùn)動(dòng)疲勞（exercise-induced fatigue，EF）是指“機(jī)體的生理過程不能維持其機(jī)能在某一特定水平或不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度”的一種生理現(xiàn)象[11]。隨著現(xiàn)代競(jìng)技運(yùn)動(dòng)競(jìng)爭(zhēng)的激烈化，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的強(qiáng)度越來(lái)越大，使得運(yùn)動(dòng)疲勞普遍存在且日益嚴(yán)重。運(yùn)動(dòng)疲勞不僅嚴(yán)重制約運(yùn)動(dòng)員專業(yè)水平的提高，并且長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)疲勞可引起機(jī)體反應(yīng)遲鈍、注意力分散、記憶和決策能力下降，甚至出現(xiàn)安全隱患。因此研究運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生機(jī)制至關(guān)重要。

紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)信息輸入的主要核團(tuán)，接受來(lái)自皮層和丘腦的谷氨酸能神經(jīng)投射以及來(lái)自中腦黑質(zhì)致密區(qū)的多巴胺能神經(jīng)投射[24,10]，在運(yùn)動(dòng)的控制和協(xié)調(diào)以及運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)中起著至關(guān)重要的作用[5]。紋狀體中約95%的神經(jīng)元為GABA能的中型棘狀神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs），是紋狀體進(jìn)行信息整合和信息傳出的主要神經(jīng)元。來(lái)自運(yùn)動(dòng)皮層的谷氨酸能纖維主要投射到紋狀體的背外側(cè)，形成皮層-紋狀體傳遞通路，具有突觸可塑性[26]，參與對(duì)隨意運(yùn)動(dòng)、運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)以及習(xí)慣性行為的調(diào)控[9]。突觸可塑性主要有兩種形式，分別為長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）和長(zhǎng)時(shí)程抑制（long-term depression，LTD）[6]。其中LTD是皮層-紋狀體通路突觸可塑性的主要形式，受內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，ECS）的調(diào)控[19]。

ECS是由內(nèi)源性大麻素（endocannabinoid，eCB）、大麻素受體以及eCB合成酶、降解酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組成的一個(gè)內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)質(zhì)系統(tǒng)，其可以調(diào)節(jié)突觸強(qiáng)度，因此在神經(jīng)發(fā)育、認(rèn)知、疼痛和運(yùn)動(dòng)控制等多種功能活動(dòng)中均起著重要的調(diào)節(jié)作用[4]。eCB主要有兩種成分，分別為花生四烯酸乙醇胺（anandamide，AEA）和2-花生四烯酸甘油（2-arachidonoyl glycerol，2-AG）[4]。大麻素受體均為具有跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體，分為兩種類型，即大麻素1型（cannabinoid 1，CB1）受體和大麻素2型（cannabinoid 2，CB2）受體。其中CB1受體主要分布于基底神經(jīng)節(jié)、海馬和小腦等腦組織，參與學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知、痛覺和運(yùn)動(dòng)控制等活動(dòng)的調(diào)節(jié)；CB2受體高度表達(dá)于免疫細(xì)胞，參與多種免疫應(yīng)答反應(yīng)[2,14]。eCB作為逆行信使，與突觸前膜的CB1受體結(jié)合后，能夠抑制突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而調(diào)節(jié)突觸的強(qiáng)度。

皮層-紋狀體通路eCB介導(dǎo)的LTD（eCB-LTD）被認(rèn)為是隨意運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)技巧性學(xué)習(xí)的細(xì)胞機(jī)制，能夠影響基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)控[19]。許多運(yùn)動(dòng)功能障礙疾病，如帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈癥和肌張力障礙等，都與皮層-紋狀體通路eCB-LTD的異常有關(guān)[7,17,22]。小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后也表現(xiàn)出動(dòng)作遲緩僵硬、不協(xié)調(diào)、姿勢(shì)失衡等行為障礙，但是關(guān)于運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠皮層-紋狀體通路eCB-LTD的研究，未見任何報(bào)道。

本研究將結(jié)合離體/腦片場(chǎng)電位記錄技術(shù)、全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)和免疫印跡技術(shù)，研究運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠皮層-紋狀體通路eCB-LTD的變化及其機(jī)制，以期探討運(yùn)動(dòng)疲勞對(duì)小鼠皮層-紋狀體通路突觸可塑性的影響，以及皮層-紋狀體通路突觸可塑性在運(yùn)動(dòng)疲勞中樞調(diào)控中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

8周齡雄性C57BL/6小鼠（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，北京）分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)過程中小鼠自由進(jìn)食飲水，自然光照。室溫22±2℃，相對(duì)濕度50%±10%。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)北京師范大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control）和運(yùn)動(dòng)疲勞組（EF）。

1.2 運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠模型的建立

參照Costa等方法[8]，利用電動(dòng)動(dòng)物跑臺(tái)（DSPT-202，杭州段氏，浙江）建立運(yùn)動(dòng)疲勞的小鼠模型。小鼠先進(jìn)行連續(xù)3天的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，15 min/天，跑臺(tái)速度為10 m/min。然后對(duì)每只小鼠的最大運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法為：小鼠以5 m/min的速度熱身運(yùn)動(dòng)3 min后，將速度提高至10 m/min運(yùn)動(dòng)1 min，隨后每min速度提高1 m/min，直到小鼠跟不上跑臺(tái)速度，持續(xù)退落至跑臺(tái)后方，該速度即為小鼠的最大運(yùn)動(dòng)速度。然后，開始連續(xù)7天的重復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，具體方法如下：5 m/min的速度熱身運(yùn)動(dòng)3 min后，將跑臺(tái)速度設(shè)定為小鼠最大運(yùn)動(dòng)速度的85 %，然后以此速度使小鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)至力竭。力竭的判定標(biāo)準(zhǔn)為：小鼠不能維持預(yù)定速度，長(zhǎng)期滯留于跑道后方不動(dòng)，使用手觸碰驅(qū)趕仍無(wú)效，并伴有呼吸急促，腹臥跑臺(tái)，垂頭不起等行為表現(xiàn)。對(duì)照組小鼠暴露在相同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，但不進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

1.3 離體腦片的制備

小鼠力竭運(yùn)動(dòng)后即刻腹腔注射戊巴比妥鈉（400 mg/kg）麻醉，斷頭處死，取出全腦，轉(zhuǎn)移至冰浴且氧飽和的改良人工腦脊液（modified artificial cerebrospinal fluid，mACSF）中，切除小腦、嗅球等部分。將剩余腦組織塊置于充滿氧飽和 mACSF的切片槽內(nèi)，利用振動(dòng)切片機(jī)（VT1000S，萊卡，德國(guó)）連續(xù)切取包含紋狀體的冠狀腦片，厚度為400 μm（場(chǎng)電位實(shí)驗(yàn)）或300 μm（膜片鉗實(shí)驗(yàn)）。將切好的腦片移至正常人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）孵育槽中，持續(xù)通入混合氣體（95% O2/ 5% CO2），31°C孵育至少1 h以上備用。mACSF的成分（mM）：2.5 KCl，1.25 NaH2PO4，26 NaHCO3，10 D-glucose，213 Sucrose，2 MgSO4，2 CaCl2。ACSF的成分（mM）：126 NaCl，2.5 KCl，2 CaCl2，2 MgSO4，26 NaHCO3，1.25 NaH2PO4，25 D-glucose。

1.4 離體腦片場(chǎng)電位記錄

將腦片移至場(chǎng)電位系統(tǒng)記錄槽中，持續(xù)灌流氧飽和的ACSF，ACSF中加入picrotoxin（50 μM，GABAa受體的拮抗劑），抑制GABAa受體介導(dǎo)的抑制性電流。如圖1所示，刺激電極（鎢電極）置于白質(zhì)，玻璃記錄電極置于紋狀體背外側(cè)，記錄皮層-紋狀體通路的興奮性突觸后場(chǎng)電位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）。記錄電極中間灌注ACSF，阻抗約為4～8 MΩ。

圖1 皮層-紋狀體通路電極位置示意圖

Figure 1. Schematic Diagram Showing the Placement of Stimulating and Recording Electrodes

LTD的誘導(dǎo)：首先通過隔離器調(diào)節(jié)刺激強(qiáng)度的大小，找到腦片的最大fEPSP，然后，以引起該最大fEPSP幅度1/2～2/3的刺激強(qiáng)度作為測(cè)試刺激強(qiáng)度，每隔30 s給予一個(gè)測(cè)試刺激。穩(wěn)定記錄15 min基線后，給予高頻刺激（high frequency stimulation，HFS，100 Hz，3 s，3串，串間隔20 s）誘導(dǎo)LTD[21]，誘導(dǎo)刺激結(jié)束后持續(xù)記錄45 min。計(jì)算HFS后35～45 min fEPSP的幅度均值與基線均值的比值，若該比值≤80 %，LTD則誘導(dǎo)成功。

eCB-LTD的驗(yàn)證：在腦片灌流的ACSF中加入CB1受體的拮抗劑AM251（1μM），采用相同的HFS方式誘導(dǎo)小鼠皮層-紋狀體通路的LTD，若LTD被阻斷，表明該LTD受eCB的調(diào)控，為eCB-LTD。

1.5 離體腦片全細(xì)胞膜片鉗記錄

膜片鉗技術(shù)是由德國(guó)生物學(xué)家Erwin Neher和Bert Sakmann于1976年創(chuàng)建的，該技術(shù)是通過記錄離子通道中的離子電流，來(lái)反映細(xì)胞膜單一或多個(gè)離子通道分子活性的技術(shù)，是研究離子通道的最重要的技術(shù)。全細(xì)胞膜片鉗記錄是膜片鉗技術(shù)的一種記錄模式，記錄的是整個(gè)細(xì)胞膜上所有離子通道的電流總和，由于其能夠保持細(xì)胞及反應(yīng)性的完整性，在神經(jīng)科學(xué)、分子生物學(xué)、病理學(xué)以及藥理學(xué)等眾多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。全細(xì)胞膜片鉗記錄的具體操作如下：

將腦片置于記錄槽中用網(wǎng)格固定，持續(xù)灌流氧飽和的ACSF。利用顯微鏡的微分干涉相差成像系統(tǒng)，選取狀態(tài)良好的背外側(cè)紋狀體MSNs。記錄電極中灌入電極內(nèi)液，電極內(nèi)液包含（mM）：140 K-gluconate，3 KCl，2 MgCl2，0.2 EGTA，10 HEPES，2 ATP（Na+鹽），用KOH將PH調(diào)至7.2，滲透壓280～290 mOsmol/L。記錄電極阻抗約4～8 MΩ。給電極施加正壓，以保持電極尖端的清潔。待電極尖端壓到MSNs，細(xì)胞可見明顯的被壓暈印，且觀察到電極阻抗上升約0.1～0.2 MΩ。此時(shí)釋放正壓并給予輕而持續(xù)的負(fù)壓，同時(shí)將放大器的鉗制電壓逐漸調(diào)整為-70 mV，形成高阻封接（電極阻抗＞1 GΩ）。待封接穩(wěn)定后給予強(qiáng)而短促的負(fù)壓或通過放大器給予Zap電流刺激，使細(xì)胞膜破裂，形成全細(xì)胞記錄模式。選取串聯(lián)電阻（series resistance,Rs）≤25 MΩ的細(xì)胞進(jìn)行記錄。

靜息膜電位（resting membrane potential）：在I=0模式下選用連續(xù)采樣模式，記錄小鼠紋狀體MSNs的靜息膜電位。

輸入阻抗（input resistance）和放電數(shù)目（number of spike）：在I-clamp模式下，通過記錄電極給MSNs注入步階變化的電流，電流的持續(xù)時(shí)間為500 ms，頻率0.1 Hz，強(qiáng)度為-100 pA～500 pA，以20 pA的步階遞增。細(xì)胞的膜電位隨著注入電流的變化而變化。細(xì)胞膜電位與注入電流的比值即為輸入阻抗，反映了細(xì)胞膜的通電特性。此外，統(tǒng)計(jì)注入300 pA電流時(shí)爆發(fā)的動(dòng)作電位個(gè)數(shù)，即放電數(shù)目。

1.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞建模后立即斷頭處死，快速分離雙側(cè)紋狀體，利用膜蛋白提取試劑盒提取紋狀體腦區(qū)的膜蛋白，并利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品中加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min變性。5 % 的濃縮膠上恒壓80 V電泳約30 min，待樣品進(jìn)入8 % 的分離膠后，恒壓110 V電泳約100 min。利用濕轉(zhuǎn)法，4℃，恒流0.25 A轉(zhuǎn)膜3 h，將SDS-PAGE膠上分離的蛋白質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫以5 %脫脂奶粉-TBST封閉1 h。TBST清洗3次，加入以2.5 %脫脂奶粉-TBST配置的CB1受體一抗（1:1000，Abcam，ab23703）和內(nèi)參β-actin一抗（1:10000，Sigma，A2066），4℃孵育過夜。TBST洗3次，每次10 min。5%脫脂奶粉-TBST配置的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:10000，Sigma，R4880）室溫孵育1 h。TBST洗3次，每次10 min。利用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影定影。采用Quantity One圖像處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮層-紋狀體通路的LTD分析

為了研究運(yùn)動(dòng)疲勞是否影響小鼠皮層-紋狀體通路的LTD，我們采用離體腦片場(chǎng)電位記錄技術(shù)，檢測(cè)了運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠和對(duì)照組小鼠皮層-紋狀體通路的LTD。結(jié)果如圖2所示，HFS（100 Hz，3 s，3串，串間隔20 s）在對(duì)照組小鼠的皮層-紋狀體通路誘導(dǎo)出穩(wěn)定且明顯的LTD，但是運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠的LTD顯著減弱（圖2C，Control：64.51±4.17 % of pre at 35～45 min，n=7 slices / 5 mice；EF：88.36±5.52 % of pre at 35～45 min，n=8 slices / 5 mice；Student’s-test，＜0.01）。結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)疲勞損害小鼠皮層-紋狀體通路的LTD。

圖2 兩組小鼠皮層-紋狀體通路的LTD

Figure 2 The Corticostriatal LTD in Two Groups

注：A：LTD誘導(dǎo)前基線（1）和LTD誘導(dǎo)后35～45 min（2）的fEPSP示例圖。B：運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠皮層-紋狀體通路的LTD顯著低于對(duì)照組小鼠。C：LTD誘導(dǎo)后35～45 min fEPSP幅度的統(tǒng)計(jì)圖。**＜0.01表示差異顯著。

2.2 CB1受體拮抗劑對(duì)小鼠皮層-紋狀體通路LTD的影響

大量文獻(xiàn)報(bào)道，紋狀體的LTD受eCB的調(diào)控[15,18]。為了檢測(cè)我們記錄的皮層-紋狀體通路LTD是否也依賴于eCB，我們?cè)贏CSF中加入了CB1受體的拮抗劑AM251（1 μM）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠的LTD被完全抑制（圖3A，Control + AM251：105.25±10.74 % of pre at 35～45 min，n=7 slices/4 mice），LTD不能被誘導(dǎo)成功，證實(shí)此皮層-紋狀體通路的LTD依賴于eCB，為eCB-LTD。

圖3 CB1受體拮抗劑對(duì)小鼠皮層-紋狀體通路LTD的影響

Figure 3 The Effect of CB1 Receptor Antagonist on Corticostriatal LTD in Control Mice

注：A：皮層-紋狀體通路LTD被CB1受體拮抗劑AM251阻斷。B：A圖中基線（1）和LTD誘導(dǎo)后35～45 min（2）的fEPSP示例圖。

2.3 小鼠紋狀體MSNs的基本電生理特性分析

MSNs的基本電生理特性能夠影響皮層-紋狀體通路的eCB-LTD。為了探究運(yùn)動(dòng)疲勞損害小鼠皮層-紋狀體通路eCB-LTD的機(jī)制，我們首先利用離體腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，檢測(cè)了兩組小鼠紋狀體MSNs的基本電生理特性，包括靜息膜電位、輸入阻抗以及注入300 pA電流時(shí)爆發(fā)的動(dòng)作電位個(gè)數(shù)等。結(jié)果如圖4A所示，對(duì)照組小鼠MSNs的靜息膜電位為-77.60±0.46 mV（n=13 cells），運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠MSNs的靜息膜電位為-77.43±0.46 mV（n=17 cells），兩組之間無(wú)顯著差異（Student’s-test，＞0.05）。兩組小鼠MSNs細(xì)胞膜的輸入阻抗也無(wú)顯著差異（圖4B，Control：127.90±4.67 MΩ，n=8 cells；EF：131.90±5.20 MΩ，n=9 cells；Student’s-test，＞0.05）。圖4C為MSNs注入300 pA電流時(shí)爆發(fā)的動(dòng)作電位示例圖。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩組小鼠MSNs在注入300 pA電流時(shí)，爆發(fā)的動(dòng)作電位數(shù)目相當(dāng)，無(wú)顯著差異（圖4D，Control：15.50±0.82，n=8 cells；EF：16.11±1.00，n=9 cells；Student’s-test，＞0.05）。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)疲勞不影響小鼠紋狀體MSNs的基本電生理特性。因此，運(yùn)動(dòng)疲勞損害小鼠皮層-紋狀體通路的eCB-LTD并不是由于MSNs的基本電生理特性改變所致。

圖4 小鼠紋狀體MSNs的基本電生理特性

Figure 4. The Basic Electrophysiological Properties of Striatal MSNs

注：A：兩組小鼠MSNs的靜息膜電位沒有差異。B: 兩組小鼠MSNs細(xì)胞膜的輸入阻抗沒有差異。C：MSNs注入300 pA電流時(shí)，爆發(fā)的動(dòng)作電位示例圖。D：兩組小鼠MSNs注入300 pA電流時(shí)，爆發(fā)的動(dòng)作電位數(shù)目無(wú)顯著差異。

2.4 小鼠紋狀體腦區(qū)CB1受體的蛋白表達(dá)水平分析

CB1受體是一種存在于腦組織中的大麻素受體，參與eCB-LTD的形成，在eCB-LTD中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。采用免疫印跡技術(shù)，我們檢測(cè)了兩組小鼠紋狀體腦區(qū)CB1受體的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組小鼠相比，運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠紋狀體腦區(qū)CB1受體的蛋白表達(dá)水平顯著提高（圖5B，Control：100.00±9.77 %，n=7；EF：144.80±11.05 %，n=7；Student’s-test，＜0.01）。

圖5 小鼠紋狀體腦區(qū)CB1受體的蛋白表達(dá)水平

Figure 5. The Expression of CB1 Receptor in the Striatum

注：A：免疫印跡結(jié)果示例圖。B：運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠紋狀體CB1受體的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。**＜0.01表示差異顯著。

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)疲勞對(duì)小鼠皮層-紋狀體通路eCB-LTD的影響

皮層-紋狀體通路是運(yùn)動(dòng)皮層信息傳入到基底神經(jīng)節(jié)的第一步，皮層-紋狀體通路的突觸可塑性能夠影響基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路中的信息傳遞，從而調(diào)控運(yùn)動(dòng)。LTD是皮層-紋狀體通路突觸可塑性的主要形式，紋狀體腦區(qū)的LTD具有與其他腦區(qū)不同的獨(dú)特特征。大部分腦區(qū)例如海馬、皮層和杏仁核等在HFS下會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生LTP，在低頻刺激（low frequency stimulation，LFS）誘導(dǎo)下產(chǎn)生LTD，而紋狀體腦區(qū)在HFS誘導(dǎo)下產(chǎn)生LTD[16]。海馬、皮層和杏仁核等腦區(qū)的LTD大多依賴于NMDA受體，而紋狀體腦區(qū)的LTD不依賴于NMDA受體，其依賴于eCB[27]，簡(jiǎn)寫為eCB-LTD。

已被證實(shí)，eCB-LTD依賴于L型Ca2+通道、代謝型谷氨酸（metabotropic glutamate,mGlu）受體、多巴胺（dopamine, DA）2型受體以及eCB的產(chǎn)生[12,3]。eCB-LTD的具體過程為：突觸后MSNs去極化，電壓門控的Ca2+通道打開，Ca2+內(nèi)流，與此同時(shí)，突觸前釋放的大量谷氨酸，與mGluR1/5結(jié)合[23]，激活G蛋白，兩者共同作用促使磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）在磷脂酶C（phospholipase C，PLC）的作用下經(jīng)過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，合成內(nèi)源性大麻素2-AG。2-AG作為逆行信使，釋放到突觸前膜，與突觸前膜上的CB1受體結(jié)合。CB1受體是G蛋白偶聯(lián)的受體，激活后可以抑制腺苷酸環(huán)化酶（adenylyl cyclase，AC）的活性，使得環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）的活性降低，下游靶蛋白的磷酸化水平降低，從而抑制突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，產(chǎn)生eCB-LTD[14]。

皮層-紋狀體通路的eCB-LTD被認(rèn)為是隨意運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)技巧性學(xué)習(xí)的細(xì)胞機(jī)制，它的改變能夠影響基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路對(duì)運(yùn)動(dòng)行為的調(diào)控[19]。研究發(fā)現(xiàn)，許多運(yùn)動(dòng)功能障礙疾病，如帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈癥和肌張力障礙等，都伴隨著皮層-紋狀體通路eCB-LTD的異常[7,17,22]。小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后也表現(xiàn)出動(dòng)作遲緩僵硬、不協(xié)調(diào)、姿勢(shì)失衡等行為異常。為了探究小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后皮層-紋狀體通路的LTD是否也發(fā)生變化，我們利用離體腦片場(chǎng)電位記錄技術(shù)，分析了運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠及對(duì)照組小鼠皮層-紋狀體通路的LTD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組小鼠中，使用HFS刺激皮層，能夠在背外側(cè)紋狀體誘導(dǎo)出非常顯著的LTD。并且這種LTD能夠被CB1受體的拮抗劑AM251阻斷，證實(shí)此LTD為eCB介導(dǎo)的eCB-LTD。而在運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠中，HFS刺激皮層誘導(dǎo)的紋狀體LTD幅度顯著低于對(duì)照組小鼠，運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠皮層-紋狀體通路的eCB-LTD受損，表明運(yùn)動(dòng)疲勞損害小鼠皮層-紋狀體通路的eCB-LTD。

3.2 運(yùn)動(dòng)疲勞損害小鼠皮層-紋狀體通路eCB-LTD的機(jī)制 探討

為了探究運(yùn)動(dòng)疲勞損害小鼠皮層-紋狀體通路eCB-LTD的機(jī)制，我們首先利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠和對(duì)照組小鼠紋狀體MSNs的基本電生理特性（包括靜息膜電位、輸入阻抗和放電數(shù)目）進(jìn)行了檢測(cè)。靜息膜電位是指細(xì)胞未受刺激時(shí)，存在于細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)的外正內(nèi)負(fù)的電位差，與K+的平衡電位有密切關(guān)系。輸入阻抗是細(xì)胞膜的被動(dòng)屬性，是由膜上的離子通道決定的。在電流鉗下給細(xì)胞注入一個(gè)小的電流，引起細(xì)胞膜電位變化，根據(jù)歐姆定律算出輸入阻抗。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠MSNs的靜息膜電位、輸入阻抗以及注入300 pA電流爆發(fā)的動(dòng)作電位數(shù)目與對(duì)照組小鼠相比，均無(wú)顯著差異，表明，運(yùn)動(dòng)疲勞不影響小鼠紋狀體MSNs的基本電生理特性。因此，運(yùn)動(dòng)疲勞導(dǎo)致小鼠皮層-紋狀體通路eCB-LTD的受損并不是由于MSNs的基本電生理特性改變引起的。

Glu是介導(dǎo)皮層-紋狀體神經(jīng)通路的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。關(guān)于運(yùn)動(dòng)疲勞后Glu含量的研究有很多，但是由于運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間的不同，以及腦區(qū)的不同，得到的結(jié)果并不一致。例如，Guezennec等報(bào)道，大鼠在力竭運(yùn)動(dòng)后紋狀體腦區(qū)Glu的含量降低[13]。Swiatkiewicz等利用質(zhì)子磁共振波譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠急性力竭運(yùn)動(dòng)后其小腦和海馬腦區(qū)的Glu信號(hào)增加，但是紋狀體腦區(qū)的Glu信號(hào)不變[25]。劉等報(bào)道運(yùn)動(dòng)疲勞后大鼠端腦的Glu含量增加[20]。Zhang等發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠下丘腦的Glu水平增加[28]。本實(shí)驗(yàn)室前期聯(lián)用微透析和高效液相色譜分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動(dòng)過程中大鼠紋狀體腦區(qū)Glu的含量升高[1]。我們推測(cè)運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠紋狀體腦區(qū)的Glu含量升高，因此，導(dǎo)致皮層-紋狀體通路的eCB-LTD受損。關(guān)于小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體的Glu含量，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，以證實(shí)我們的推測(cè)。

CB1受體是突觸前膜上接受eCB激活的一種受體。利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)小鼠紋狀體腦區(qū)CB1受體的蛋白表達(dá)含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠紋狀體腦區(qū)CB1受體的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。由于CB1受體被內(nèi)源性大麻素2-AG激活后，通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，能夠抑制突觸前Glu的釋放，因此，我們認(rèn)為運(yùn)動(dòng)疲勞組小鼠紋狀體腦區(qū)CB1受體表達(dá)上調(diào)，是機(jī)體為了消除Glu的過度累積，做出的一種積極的代償反應(yīng)。

4 小結(jié)

我們發(fā)現(xiàn)小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后，紋狀體MSNs的基本電生理特性不變，但是HFS誘導(dǎo)的皮層-紋狀體通路eCB-LTD受損。此外，運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠紋狀體腦區(qū)CB1受體的蛋白表達(dá)水平升高，這可能是機(jī)體對(duì)受損的eCB-LTD的一種代償反應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果第1次發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠皮層-紋狀體通路的eCB-LTD減弱，提示皮層-紋狀體通路突觸可塑性異常，可能是運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生或維持的機(jī)制之一。重塑皮層-紋狀體通路的eCB-LTD，可能延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生，因此，在皮層-紋狀體通路eCB-LTD過程中起重要作用的通道或受體，例如，L型Ca2+通道、mGlu受體，D2受體以及CB1受體等，均可能是延緩運(yùn)動(dòng)疲勞藥物的新靶點(diǎn)。本文的研究結(jié)果有助于進(jìn)一步完善運(yùn)動(dòng)疲勞中樞機(jī)制的理論知識(shí)，并為延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的藥物研發(fā)提供了新的啟示。

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CB1 Receptor Involved in the Impairment of Exercise-induced Fatigue on Corticostriatal eCB-LTD

MA Jing, CHEN Hui-min, LIU Xiao-li, QIAO De-cai

Beijing Normal University, Beijing 100875, China.

Objective: The aim of the present study is to investigate the effect of exercise-induced fatigue on corticostriatal synaptic plasticity by observing the changes of endocannabinoid-mediated long-term depression (eCB-LTD) after exercise-induced fatigue. Methods: Adult male C57BL/6 mice were randomly divided into two groups: control mice and exercise-induced fatigue (EF) mice. Electric treadmill was used to establish a repetitive exhausted EF mouse model. The corticostriatal LTD of two groups were examined by using in vitro field excitatory postsynaptic potential (fEPSP) recording technique. And the CB1 receptor antagonist AM251 was applied to examine whether this corticostriatal LTD was eCB-dependent. In vitrowhole-cell patch clamp recording was used to detect the basic electrophysiological properties of medium spiny neurons (MSNs). Western blotting was used to examine the expression of CB1 receptor in the striatum. Results: 1) The corticostriatal LTD in EF mice was significantly impaired compared with the control group (P < 0.01), and the LTD was blocked by CB1 receptor antagonist AM251, thus it was eCB-LTD. 2) The basic electrophysiological properties of MSNs in EF mice were normal (＞0.05). 3) Compared with the control group, the striatal expression of CB1 receptor in EF mice was significantly increased (＜0.01). Conclusion: The corticostriatal eCB-LTD was impaired in EF mice, but the basic electrophysiological properties of MSNs were normal, whereas the elevated CB1 receptor expression may be a compensatory response to the eCB-LTD deficit. Our results demonstrate that EF impairs the corticostriatal eCB-LTD for the first time, and suggest that the aberrant corticostriatal synaptic plasticity may be involved in the production and/or maintenance of EF.

1000-677X(2018)03-0027-07

10.16469/j.css.201803003

G804.2

A

2017-12-29;

2018-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31701038,31571221);中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2017M610793)。

馬婧,女,博士,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生理與神經(jīng)生物學(xué),E-mail: majing_0816@163.com; 喬德才,男,教授,博士,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生理與神經(jīng)生物學(xué),E-mail: decaiq@bnu. edu.cn; 劉曉莉,女,教授,博士,研究方向?yàn)轶w育保健與運(yùn)動(dòng)康復(fù),E-mail: xiaolil@bnu. edu.cn。