抗阻運動激活FSTL1-Akt-mTOR信號通路促進心梗大鼠心肌細胞增殖

田振軍，郝美麗，席 悅

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抗阻運動激活FSTL1-Akt-mTOR信號通路促進心梗大鼠心肌細胞增殖

田振軍，郝美麗，席 悅

陜西師范大學(xué) 體育學(xué)院 暨運動生物學(xué)研究所 運動與心血管健康研究室, 陜西 西安 710062.

目的：探討抗阻運動對心肌梗死（Myocardial Infarction，MI）大鼠卵泡抑素樣蛋白1 （Follistatin-like Protein 1，F(xiàn)STL1）及其受體DIP2A（Disco-interacting Protein 2 homolog A）表達和下游Akt-mTOR信號通路與心肌細胞增殖的影響。方法：雄性SPrague-Dawley大鼠30 只，體重180～220 g，左冠狀動脈前降支結(jié)扎制備心梗模型，術(shù)后隨機分為假手術(shù)組（S）、心梗安靜對照組（MI）、心梗+抗阻運動組（MR），每組10只，其中S組只穿線不結(jié)扎。術(shù)后1周，MR組先進行1周適應(yīng)性無負重爬梯運動，再進行4周遞增負荷抗阻運動。訓(xùn)練結(jié)束后24 h，腹腔麻醉，測定LVSP、LVEDP和±dP/dt max評價心功能。Western blot實驗測定心肌FSTL1/DIP2A、PAkt/Akt、P-mTOR/mTOR、CyclinD1、CDK4蛋白表達；免疫熒光實驗觀察心肌細胞增殖；Masson染色觀察并計算心肌膠原容積百分比（CVF%）。結(jié)果：與S組比較，MI組心肌FSTL1/DIP2A、CyclinD1和CDK4蛋白表達增加，PAkt/Akt、P-mTOR/mTOR比值顯著上升，心肌細胞增殖百分率顯著升高，CVF%和LVEDP顯著增加，LVSP和±dP/dt max顯著降低；與MI組比較，MR組心肌FSTL1/DIP2A、CyclinD1和CDK4蛋白表達顯著升高，PAkt/Akt、P-mTOR/mTOR比值顯著上升，心肌細胞增殖百分率顯著升高，CVF%和LVEDP顯著降低，LVSP和±dP/dt max顯著升高。結(jié)論：抗阻運動上調(diào)FSTL1及其受體DIP2A的表達，激活其下游Akt-mTOR信號通路。表明，F(xiàn)STL1-DIP2A-Akt-mTOR信號通路在抗阻運動促進心梗大鼠心肌細胞增殖、降低心肌纖維化面積和改善心功能中發(fā)揮重要作用。

抗阻運動；心肌梗死；卵泡抑素樣蛋白1；FSTL1-Akt-mTOR信號通路；心肌細胞增殖

心肌梗死（MyocardialInfarction，MI）后心肌嚴重缺血缺氧導(dǎo)致心肌細胞大量丟失和心功能惡化是造成心力衰竭的重要原因[27,17]，如何預(yù)防和治療MI一直是國內(nèi)外學(xué)者高度關(guān)注的問題。研究表明，運動鍛煉是預(yù)防和治療心血管疾病，尤其是MI的重要臨床干預(yù)措施[10]，運動可顯著減少心肌凋亡和壞死[12]，降低心肌纖維化水平[40]，促進血管生成[29]，誘導(dǎo)心肌細胞增殖[6]，改善左心室病理重構(gòu)并提高心肌收縮力以及左心室功能[11,13]。有文獻表明，抗阻運動顯著提高MI大鼠心血管的自主調(diào)節(jié)能力，是MI康復(fù)安全有效的方法[14]，但其康復(fù)靶點與機制需要深入探討。

卵泡抑素樣蛋白1（Follistatin-like Protein 1，F(xiàn)STL1）是分泌型的細胞外基質(zhì)糖蛋白，最初由小鼠成骨細胞的細胞系MC3T3-E1中克隆得到[30]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)STL1在心、腎和肺等多個器官中均有表達[2]，并有可能作為急性冠狀動脈綜合征預(yù)后的生物標(biāo)志物[36]，在細胞的增殖與分化[9]、肥大[33]、抗凋亡和炎癥反應(yīng)[21]、血管再生[23]等方面發(fā)揮重要作用。FSTL1與心肌細胞膜上受體DIP2A（Disco-interacting Protein 2 homolog A）結(jié)合激活A(yù)kt信號發(fā)揮心臟保護作用[24]。主動脈狹窄、缺血/再灌注損傷和MI導(dǎo)致心臟FSTL1表達上調(diào)。FSTL1過表達或小RNA干擾可通過PI3K-Akt-mTOR和Erk1/2信號通路，影響心肌細胞凋亡[22]。增加心外膜FSTL1表達可減少MI大鼠心肌纖維化，或激活PI3K-Akt通路可誘導(dǎo)心肌細胞增殖[35,37]。本研究前期報道，運動可上調(diào)MI心臟FSTL1蛋白表達，誘導(dǎo)血管新生[1]，但運動是否能激活MI心臟FSTL1-DIP2A-Akt-mTOR信號通路，誘導(dǎo)心肌細胞增殖，發(fā)揮心臟保護作用，目前尚無文獻報道。本文采用抗阻運動方式對上述問題進行探討，為MI心臟運動康復(fù)手段和方法篩選提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：小動物呼吸機（ALC-V8）、生物信號采集系統(tǒng)（Power-Lab/8ST）、電泳儀和多色凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad ChemiDocTMMP）、病理組織包埋機（BM-II）、石蠟切片機（LEICA-RM2126）、生物組織攤烤片機（YT-6C）、光學(xué)顯微鏡（OlymPus BX51）、熒光顯微鏡（Nikon EcliPse 55i）等。

主要試劑：兔多克隆抗體FSTL1（GeneTex）、DIP2A（Biorbyt）、PAkt、Akt、P-mTOR、mTOR、Cyclin D1和小鼠多克隆抗體PCNA（CST）、CDK4（Snata Cruz）、兔多克隆抗體cTnT（北京博奧森）、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、Dylight 594標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗等。

1.2 實驗動物與分組

SPrague-Dawley雄性大鼠購于西安交通大學(xué)動物實驗管理中心，體重為180～220 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，左冠狀動脈前降支結(jié)扎法制備MI模型，術(shù)后存活20只，隨機分為心梗安靜對照組（MI）、心梗+抗阻運動組（MR），每組10只。另選取10只大鼠作為假手術(shù)對照組（S），只穿線不結(jié)扎。大鼠分組后，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由進食飲水。S組和MI組不運動，MR組進行負重爬梯訓(xùn)練。

1.3 MI模型制備和抗阻運動方案

MI模型制備：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（5%，30 mg/kg）麻醉，呼吸面罩輔助呼吸并連接心電圖全程記錄。常規(guī)開胸暴露出心臟，于左心耳和肺動脈圓錐交界以下2 mm處進針，結(jié)扎左冠狀動脈前降支。以心電圖ST段抬高或T波倒置，結(jié)扎處以下心肌顏色變淺或變白為手術(shù)成功，常規(guī)關(guān)胸護理。

抗阻運動方案：依據(jù)文獻和預(yù)實驗確定抗阻運動方案[4,14]。MR組術(shù)后1周開始進行爬梯抗阻運動，爬梯高為1.1 m，間隔為2 cm，傾斜度為85°。第1周為無負重適應(yīng)性訓(xùn)練，之后進行4周遞增負荷爬梯運動，每天遞增體重的10%，當(dāng)負荷遞增至體重的75%后，保持75%體重的負荷直到訓(xùn)練結(jié)束，5 d/周×4周。

1.4 心功能測定、取材和樣品處理

4周訓(xùn)練結(jié)束24 h后，腹腔麻醉，常規(guī)血流動力學(xué)方法測定心功能。導(dǎo)管經(jīng)右頸總動脈逆行插入至左心室，Power-Lab/8ST生物信號采集系統(tǒng)記錄左心室收縮壓（left ventricular systolic Pressure，LVSP）、左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic Pressure，LVEDP）和左心室壓力最大上升和下降速率（±dP/dt max）等。之后即刻開胸摘取心臟，生理鹽水清洗殘血（0～4 ℃），6只心臟液氮固定24 h后移至-80 ℃冰箱保存，用于Western blot實驗，另4只心臟10%中性甲醛固定，用于組織學(xué)實驗。

1.5 Western blot 實驗

取心梗邊緣區(qū)心肌組織50 mg，加入預(yù)冷蛋白抽提試劑500μl，剪碎勻漿，4 °C離心，取上清液，BCA蛋白定量。常規(guī)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h，孵育一抗FSTL1（1:1 000）、DIP2A（1:200）、PAkt（1:2 000）、Akt（1:1 000）、P-mTOR/mTOR（1:1 000）、CyclinD1（1:400）、CDK4（1:200）、內(nèi)參為GAPDH（1:8 000），4 ℃過夜。次日室溫復(fù)溫30 min，TBST清洗5 min/次×5次，室溫孵育二抗（1:8 000）1 h，TBST清洗二抗5 min/次×5次，ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像與分析。

1.6 Masson染色

取固定48 h后心臟，流水沖洗5 h，梯度酒精脫水、三氯甲烷透明，石蠟常規(guī)浸蠟和包埋，連續(xù)切片（5 μm）制片，Masson染色，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，OlymPus BX51光學(xué)顯微鏡下觀察拍片，Image-Pro Plus 5.1軟件測定藍色膠原面積，計算心肌膠原面積百分比（CVF%），CVF%＝膠原面積/心肌組織總面積×100%。

1.7 免疫熒光實驗

石蠟切片脫蠟至水，PBS清洗，微波抗原修復(fù)，室溫冷卻，PBS清洗5 min/次×3次，5%BSA室溫封閉1 h，甩去BSA，滴加小鼠來源的一抗PCNA（1:100）和兔來源的cTnT（1:100）混合抗體，4 ℃過夜。次日室溫復(fù)溫45 min，PBS清洗，避光滴加Dylight 594標(biāo)記的山羊抗小鼠（1:100）二抗、FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:100）和DAPI（1:800）的混合液，37℃避光孵育1 h后，PBS清洗5 min/次×5次（避光），封片，Nikon EcliPse 55i 熒光顯微鏡觀察拍片。同時設(shè)置空白對照和陰性對照。

1.8 圖像與數(shù)據(jù)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 抗阻運動上調(diào)MI心臟FSTL1及其受體DIP2A蛋白表達

Western Blot結(jié)果顯示，與S組比較，MI組FSTL1蛋白表達顯著上調(diào)（＜0.01），DIP2A蛋白表達升高，但無顯著差異。與MI組比較，MR組FSTL1及其受體DIP2A蛋白表達均顯著增加（＜0.01）。表明，MI心臟FSTL1及其受體DIP2A表達出現(xiàn)代償性升高，而抗阻運動可顯著增加MI心臟FSTL1及其受體DIP2A 表達（圖1）。

圖1 MI心臟FSTLI及其受體DIP2A蛋白表達結(jié)果

Figure 1 The Protein Expression Result of FSTL1 and Its Receptor DIP2A in MI Heart

2.2 抗阻運動激活MI心臟PI3K/Akt信號通路

Western Blot結(jié)果顯示，與S組比較，MI組PAkt/Akt、P-mTOR/mTOR的比值均顯著增加（＜0.05），CyclinD1和CDK4蛋白表達均顯著增加（＜0.01，＜0.05）；與MI組比較，MR組PAkt/Akt、P-mTOR/mTOR的比值均顯著升高（＜0.01，＜0.05），CyclinD1和CDK4蛋白表達均顯著升高（＜0.05）。表明，MI后PI3K/Akt通路的磷酸化水平代償性上調(diào)，抗阻運動可有效激活PI3K/Akt通路，啟動細胞增殖周期（圖2）。

2.3 抗阻運動誘導(dǎo)MI大鼠心肌細胞增殖

免疫熒光結(jié)果顯示，PCNA為細胞增殖核抗原，呈紅色熒光（圖3，A～C）；cTnT為心肌肌鈣蛋白，標(biāo)記心肌細胞，呈綠色熒光（圖3，D～F）；DAPI標(biāo)記細胞核，呈藍色熒光（圖3，G～I）。PCNA+/cTnT+雙陽性，表示新生的心肌細胞。與S組比較，MI組PCNA+/cTnT+心肌細胞數(shù)目增多，心肌細胞增殖百分率顯著增加（＜0.01）；與MI組比較，MR組PCNA+/cTnT+心肌細胞數(shù)目增多，心肌細胞增殖百分率顯著升高（＜0.05）。表明，MI后心肌細胞增殖出現(xiàn)代償性增加，抗阻運動可顯著誘導(dǎo)MI大鼠心肌細胞增殖（圖3，J～P）。

2.4 抗阻運動降低MI心臟的心肌纖維化面積，改善心功能

圖2 MI心臟PAkt/Akt、P-mTOR/mTOR、CyclinD1和CDK4蛋白表達結(jié)果

Figure 2. The Protein Expression Result of PAkt/Akt、P-mTOR/mTOR、CyclinD1 and CDK4 in MI Heart

Figure 3. The Immunofluorescence Result of Cardiomyocyte Proliferation in MI Heart

注：Masson染色，心肌細胞為紫紅色，膠原纖維為藍色，細胞核為藍紫色。A為S組；B為MI組，E為MI組局部放大；C為MR組，F(xiàn)為MR組局部放大；D為膠原容積百分數(shù)統(tǒng)計比較。

Figure 4. The Masson Staining Result of Myocardium in MI Heart

圖5 MI心臟血流動力學(xué)測試結(jié)果

Figure 5. The Result of Hemodynamic Index in MI Heart

光鏡觀察Masson染色結(jié)果顯示，細胞核呈藍紫色，心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色。與S組比較，MI組心肌組織發(fā)生替代性纖維化，CVF%顯著增加（＜0.01）；與MI組比較，MR組膠原纖維有所減少，CVF%顯著降低（＜0.01）。表明，MI后膠原纖維過度增生，抗阻運動可抑制膠原纖維的進一步擴大，降低纖維化面積程度（圖4，A-F）。

心功能結(jié)果顯示，與S組比較，MI組LVSP、±dP/dt max均顯著降低（＜0.01），LVEDP顯著升高（＜0.01）；與MI組比較，MR組LVSP、±dP /dt max均顯著上升（＜0.05，＜0.01，＜0.05），LVEDP顯著下降（＜0.05），表明，MI后心功能顯著降低，抗阻運動可顯著改善心功能（圖5）。

2.5 心肌FSTL1蛋白表達與細胞增殖百分率、CVF%、心功能變化的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，MI及MI抗阻運動后，心肌FSTL1蛋白表達與心肌細胞增殖百分率呈顯著正相關(guān)（=0.761，＜0.01），與CVF%呈顯著負相關(guān)（=-0.822，＜0.01）。表明，在MI條件下，隨著心肌FSTL1蛋白表達升高，心肌細胞增殖增加，心肌膠原面積減少。心肌細胞增殖百分率與LVSP、+dP /dt max、-dP /dt max呈顯著正相關(guān)（=0.872，＜0.01；=0.708，＜0.05；=0.780，＜0.01），與LVEDP呈顯著負相關(guān)（=-0.679，＜0.01）。表明，隨著心肌細胞增殖的增加，MI大鼠心功能顯著改善。

3 分析與討論

研究證實，F(xiàn)STL1在促進心肌細胞增殖、降低心肌纖維化[35]、抑制心肌細胞凋亡[21]和誘導(dǎo)心肌血管再生[1]等方面，可作為心臟保護因子發(fā)揮重要作用。內(nèi)源性干預(yù)證實，缺血再灌注小鼠內(nèi)源性高表達，可顯著降低心梗面積和細胞凋亡[22]，特異性敲除小鼠心肌基因后，壓力超負荷心臟表現(xiàn)出心肌病理性肥大和心功能損害[31]。外源性干預(yù)表明，注射FSTL1重組蛋白可顯著降低心梗面積[21]。表明，F(xiàn)STL1在抑制病理性心臟的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細胞和心肌細胞膜上有FSTL1受體DIP2A分布，F(xiàn)STL1與DIP2A結(jié)合可激活下游Akt信號，發(fā)揮心臟保護作用。FSTL1也可直接激活PI3K-Akt-mTOR和Erk1/2信號[22]。小RNA干擾降低DIP2A表達后，Akt磷酸化水平顯著降低[24]。表明，F(xiàn)STL1直接激活或與DIP2A結(jié)合激活PI3K-Akt-mTOR和Erk1/2信號[20]。本研究前期發(fā)現(xiàn)，抗阻運動干預(yù)顯著增加MI心肌的FSTL1蛋白表達[1]。本研究結(jié)果顯示，MI后進行抗阻運動可顯著升高DIP2A蛋白表達，激活A(yù)kt和mTOR磷酸化水平。文獻報道，運動可激活PI3K-Akt-mTOR信號通路[42]，該信號通路在促進心肌細胞增殖與抑制凋亡中發(fā)揮重要作用。因此認為，抗阻運動發(fā)揮心梗心臟保護效應(yīng)的機制，可能是通過上調(diào)MI大鼠心肌FSTL1及其受體DIP2A蛋白表達，激活A(yù)kt-mTOR信號通路而發(fā)揮作用。

細胞周期激活是心肌細胞增殖的必備條件，其關(guān)鍵點在G1期和S期之間。Cycin/CDK復(fù)合物可調(diào)控細胞周期從G1期與S期的轉(zhuǎn)化，啟動細胞周期[18]。CyclinD可結(jié)合并激活CDK進而誘導(dǎo)心肌細胞增殖，PI3K-Akt信號激活后可上調(diào)CyclinD和CDK4的表達，誘導(dǎo)細胞增殖[19,32]。諸多文獻表明，跑臺或游泳等耐力運動可激活內(nèi)源性c-kit+心臟干細胞和sca-1+心臟祖細胞分化為心肌細胞[34,38]，發(fā)揮心臟重塑作用[16]。跑臺運動可增加正常大鼠心臟ki67和BrdU標(biāo)記的心肌細胞數(shù)目[34]，上調(diào)MI大鼠心肌PCNA表達[8]；游泳運動可增加缺血再灌注小鼠心肌ki67和EdU表達水平[39]，上調(diào)壓力超負荷致小鼠病理性肥厚心肌的PCNA、磷酸化H3、BrdU和AuroraB表達水平[7]。表明，耐力運動可誘導(dǎo)心臟干/祖細胞的增殖效應(yīng)。但有關(guān)抗阻運動與心臟干/祖細胞研究的報道尚少。本研究結(jié)果表明，4周抗阻運動顯著增加MI大鼠心臟的CyclinD1、CDK4表達和PCNA+/cTnT+雙陽性心肌細胞數(shù)目。推測，抗阻運動對MI心臟的保護效應(yīng)，可能通過刺激FSTL1表達，并與其受體DIP2A結(jié)合或直接激活PI3K-Akt-mTOR信號，參與心肌細胞增殖，發(fā)揮缺血心臟的保護作用。

動物實驗和臨床研究表明，MI后早期運動訓(xùn)練可減少心臟膠原纖維含量，降低纖維化，改善心肌收縮力和左心室功能[13,41]。長期有氧運動可抑制大鼠缺血/再灌注心肌凋亡，改善心臟舒/縮功能[42]。適宜強度的抗阻運動在動物和人正常心臟重塑[3]、心血管功能調(diào)節(jié)及適應(yīng)過程中[26,25]，均發(fā)揮積極效應(yīng)，亦可改善MI致心衰大鼠的心功能，減弱心臟病理性肥大，降低左心室膠原蛋白沉積和炎癥反應(yīng)[4]；抑制鹽超載誘導(dǎo)的大鼠心室重構(gòu)和左室舒張壓紊亂[5]，下調(diào)糖尿病大鼠的心臟氧化應(yīng)激水平[28]，改善其心功能[15]，因此認為，無論是針對正常心臟或病理性心臟，抗阻運動均可產(chǎn)生積極效應(yīng)。本研究結(jié)果表明， 4周抗阻運動顯著降低MI后心肌CVF%和LVEDP，顯著提高LVSP和±dP/dt max，且增殖的心肌細胞數(shù)目與FSTL1表達水平和心功能改善呈顯著正相關(guān)，與心肌纖維化面積呈顯著負相關(guān)。提示，抗阻運動可能通過激活心肌FSTL1-DIP2A-Akt-mTOR信號通路，促進心肌細胞增殖，降低MI心臟纖維化，顯著改善心功能。

4 結(jié)論

抗阻運動上調(diào)FSTL1及其受體DIP2A的表達，激活其下游Akt-mTOR信號通路。表明，F(xiàn)STL1-DIP2A-Akt-mTOR信號通路在抗阻運動促進心梗大鼠心肌細胞增殖、降低心肌纖維化面積和改善心功能中發(fā)揮重要作用。

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Resistance Training Activates the Signaling Pathway of FSTL1-Akt-mTOR and Induces Cardiomyocyte Proliferation in Rats with Myocardial Infarction

TIAN Zhen-jun，HAO Mei-li，XI Yue

Shaanxi Normal University Xi' an 710062, China.

Objectives: This study aimed at discussing the effect of resistance training on expression of Follistatin-like protein 1(FSTL1) and its receptor Disco-interacting protein 2 homolog A( DIP2A) , downstream signaling pathway of Akt-mTOR and cardiomyocyte proliferation in rats with MyocardialInfarction(MI). Methods: 30 male Sprague-Dawley rats, weight about 180-220g were randomly divided into three groups: Sham-operated group(S), sedentary MI group(MI) and MI with resistance training group(MR) after the MI model was established by ligation of left anterior descending coronary artery. After surgery 1 week, rats in MR took adaptability climbing up ladder unload training for 1 week. Then subjected progressive loading training for 4 weeks. The 24 hours after training, rats were anesthetized, the LVSP, LVEDP, ±dp/dt max were tested in order to evaluate cardiac function. The protein expression of FSTL1, DIP2A, pAkt, Akt, p-mTOR, mTOR, CyclinD1 and CDK4 in Myocardium were measured by Western blot, cardiomyocyte proliferation was observed and analyzed by immunofluorescence. Collagen volume fraction(%) of Myocardium were calculated by Masson Staining. Results: Compared with S, the protein expression of FSTL1, DIP2A, pAkt/Akt, p-mTOR/mTOR, CyclinD1 and CDK4, cardiomyocyte proliferation, the CVF% and LVEDP of MI increased, the LVSP and ±dp/dt max significantly decreased; Compared with MI, the protein expression of FSTL1, DIP2A, pAkt/Akt, p-mTOR/mTOR, CyclinD1 and CDK4, cardiomyocyte proliferation, the CVF% and LVEDP of MR significantly upregulated, the LVSP, ±dp/dt max significantly downregulated. Conclusions: Resistance training may via upregulate the expression of FSTL1 and its receptor DIP2A in Myocardium, activates the signaling pathway of Akt-mTOR, induces cardiomyocyte proliferation, and improves cardiac function.

1000-677X(2018)03-0040-08

10.16469/j.css.201803005

G804.5

Ａ

2017-07-07；

2018-02-27

國家自然科學(xué)基金(31371199)資助項目。

田振軍,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要研究方向為運動與心血管健康,Email:tianzj611@hotmail.com; 郝美麗,女,在讀碩士生,主要研究方向為運動與心血管健康; 席悅,男,在讀博士生,主要研究方向為運動與心血管健康。