藜麥中槲皮素和山柰酚含量測定研究

熊成文，李曉偉，徐得娟

（1.青海省食品檢驗(yàn)檢測院，青海西寧 810016；2.青海高遠(yuǎn)錦禾生態(tài)農(nóng)牧科技有限公司，青海西寧 810016）

藜麥（Chenopodium quinoa）是南美洲安第斯山脈地區(qū)的重要作物[1]，藜麥籽實(shí)富含大量人體必需的維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物以及天然抗氧化物質(zhì)，藜麥被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）評為21世紀(jì)具有保護(hù)糧食安全使命的作物之一[2-5]。藜麥籽實(shí)是黃酮化合物的良好來源，槲皮素和山柰酚是藜麥的主要黃酮化合物，而常見谷物如小麥、大麥和燕麥等不含有黃酮類化合物[6-8]。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎以及防癌抗癌的作用[9-11]，是對健康有益的成分，因此，藜麥可作為提高健康水平的生物活性物質(zhì)的來源[12-13]。

本試驗(yàn)通過優(yōu)化提取工藝，進(jìn)行了方法學(xué)考察，建立了藜麥中槲皮素和山柰酚的HPLC測定方法，并對不同產(chǎn)地和不同加工方法的藜麥籽實(shí)中槲皮素和山柰酚的含量進(jìn)行了比較，旨在為更好地評價(jià)藜麥的品質(zhì)提供一種簡便、可行、重復(fù)性好的質(zhì)量控制方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑 供試樣品藜麥為青藜一號，產(chǎn)自海拔3 100 m的青海省海西州都蘭縣香加鄉(xiāng)，由青海高遠(yuǎn)錦禾生態(tài)農(nóng)牧科技有限公司提供；槲皮素對照品，由上海金穗生物科技有限公司提供（批號20160709，含量≥98%）；山柰酚對照品，由上海金穗生物科技有限公司提供（批號20160817，含量≥98%）。甲醇為色譜純，磷酸、鹽酸等其他試劑均為分析純，水為實(shí)驗(yàn)室三級用水。

1.1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀（Waters e2695，美國Waters公司），配有二極管陣列檢測器（Waters 2996，美國 Waters公司），色譜工作站（Empower，美國Waters公司）。電子天平（FA2004，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，常州智博瑞儀器制造有限公司）；超聲波清洗機(jī)（JP-030S，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 混合對照品溶液的制備 取槲皮素對照品20mg、山柰酚對照品10mg，精密稱定，分別置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取1.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL中含20 μg槲皮素和10 μg山柰酚的混合對照品溶液。

1.2.2 高效液相色譜分析條件 色譜柱采用Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（55∶45）；檢測波長 360 nm；流速 1.0 mL/min；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 20 μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 精密量取混合對照品溶液 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分別置 10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得系列混合對照品溶液。分別精密量取系列混合對照品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別以混合對照品溶液的質(zhì)量濃度（C，mg/L）為橫坐標(biāo)，測得峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 供試品溶液的制備 取藜麥樣品適量，研細(xì)，過0.25 mm篩，取約1.0 g，精密稱定，置100 mL具塞三角瓶中，加80%甲醇溶液50 mL，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h，再回流提取1 h，取出，放至室溫，用80%甲醇溶液補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，置100 mL具塞三角瓶中，加濃鹽酸5 mL，回流水解1 h，水解液轉(zhuǎn)移置100 mL量瓶中，加80%甲醇溶液稀釋至刻度，微孔濾膜（0.45μm）過濾，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇 嘗試使用甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、甲醇-醋酸溶液、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-醋酸溶液等洗脫系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-水和乙腈-水洗脫系統(tǒng)所得色譜峰存在拖尾現(xiàn)象，比較磷酸、冰醋酸等掃尾劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磷酸改善峰形的效果更好，甲醇-磷酸溶液和乙腈-磷酸溶液對色譜峰的分離無明顯差異，因此，使用經(jīng)濟(jì)性較好的甲醇-磷酸溶液洗脫系統(tǒng)，通過調(diào)整流動相的比例，選用甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.5%磷酸（體積比55∶45）時(shí)，樣品中待測組分分離效果較好，槲皮素、山柰酚二組分能完全分離。色譜圖如圖1所示。

2.1.2 紫外檢測波長的選擇 槲皮素在254，360 nm處、山柰酚在265，360 nm處有最大吸收，比較254，265，360 nm波長處對藜麥樣品含量測定時(shí)的影響，槲皮素、山柰酚均在360 nm波長靈敏度較高，并且沒有雜質(zhì)干擾。因此，確定360 nm作為檢測波長[14]。

2.1.3 提取方法和溶劑對色譜含量測定的影響比較超聲提取法、索氏提取法和回流提取法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，索氏提取法與回流提取法測得的含量接近，超聲提取法提取完全，待測組分含量最高?？疾焐V甲醇、體積分?jǐn)?shù)60%，70%，80%的甲醇溶液、無水乙醇、體積分?jǐn)?shù)50%，70%，90%的乙醇溶液作提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液的提取效率最高。因此，選擇體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液作為提取液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A＝66 688C－21 325（r＝0.999）；山柰酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A＝80 912C＋5 517.4（r＝0.999）。結(jié)果表明，槲皮素、山柰酚的質(zhì)量濃度分別在1.0～20.0 mg/L，0.5～10.0 mg/L范圍內(nèi)與所測得的相應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度

取槲皮素和山柰酚的質(zhì)量濃度分別為4.0，2.0 mg/L的混合對照品溶液，按1.2.2色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別為0.4%和1.3%，說明儀器的精密度良好。

2.4 重復(fù)性

取藜麥籽實(shí)粉約1 g，精密稱定，按1.2.4步驟平行制備供試品溶液6份，按1.2.2色譜條件進(jìn)樣分析，記錄槲皮素和山柰酚色譜圖。計(jì)算槲皮素和山柰酚的平均含量分別為506.8，91.8 μg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）所示分別為1.6%和1.6%。說明該方法的重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性考察

取室溫放置的供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h，按1.2.2色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。計(jì)算槲皮素和山柰酚峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.5%和1.8%。表明室溫放置的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 回收率

稱取含量已知的藜麥籽實(shí)粉約0.5 g（槲皮素、山柰酚含量分別為 506.8，91.8 μg/g），精密稱定，共9份，按含量低、中、高分別加入不同體積的槲皮素和山柰酚對照品溶液，使其分別相當(dāng)于藜麥籽實(shí)原有含量的75%，100%，125%，每一質(zhì)量濃度重復(fù)3份，按1.2.4步驟制備供試品溶液，在1.2.2色譜條件下進(jìn)行分析，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示。槲皮素的回收率平均為91.0%，RSD為0.4%（n＝9）；山柰酚的回收率平均為89.3%，RSD為1.6%（n＝9）。表明上述方法的回收率符合要求，準(zhǔn)確度良好。

表1 槲皮素和山柰酚的加樣回收結(jié)果

2.7 樣品含量測定

分別取9個產(chǎn)地和不同加工工藝處理后的藜麥粉各1 g，精密稱定，按1.2.2色譜條件和方法測定藜麥樣品，計(jì)算槲皮素和山柰酚的含量（表2）。

表2 不同地區(qū)藜麥中槲皮素和山柰酚含量測定結(jié)果

續(xù)表2

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了同時(shí)測定藜麥中的槲皮素和山柰酚2種黃酮類物質(zhì)的高效液相色譜方法，樣品用80%甲醇溶液超聲波及回流提取后再加濃鹽酸水解，水解液采用高效液相色譜法測定，可在20 min內(nèi)完成槲皮素和山柰酚的含量測定。通過對樣品提取方法和溶劑的優(yōu)化，并選擇甲醇-0.4%磷酸（體積比55∶45）為流動相，明顯改善了峰形，以槲皮素和山柰酚均有較高靈敏度且無雜質(zhì)干擾的360 nm作為檢測波長，方法的線性范圍、精密度、回收率、穩(wěn)定性等均在液相色譜法允許的范圍內(nèi)，可在較寬濃度范圍內(nèi)對藜麥中的槲皮素和山柰酚進(jìn)行同時(shí)分析，有助于提高藜麥檢測的分析效率，降低檢測成本，為藜麥的品質(zhì)評價(jià)提供了一種簡便可行、重復(fù)性好的質(zhì)量控制方法。

4 討論

如果樣品不經(jīng)水解，測得各產(chǎn)地藜麥籽實(shí)中槲皮素和山柰酚的含量普遍較低，這與文獻(xiàn)中報(bào)道[15]的槲皮素和山柰酚在藜麥中多以苷的形式存在的結(jié)果相一致，所以，需要用鹽酸水解的方法水解得到槲皮素和山柰酚。考察25 mL供試品提取溶液中加入不同體積的濃鹽酸5，10，15 mL，結(jié)果加入濃鹽酸5 mL時(shí)提取液中的槲皮素和山萘酚即可完全水解，因此，采用25 mL供試品提取液中加入5 mL濃鹽酸水解。

試驗(yàn)結(jié)果表明，國內(nèi)藜麥中槲皮素含量明顯高于山柰酚，進(jìn)口原產(chǎn)地藜麥中槲皮素和山萘酚的含量相當(dāng)，甚至山萘酚含量會高于槲皮素。不同產(chǎn)地藜麥籽實(shí)中2種黃酮苷元含量存在明顯差異，其中，青海省海西州都蘭縣香加鄉(xiāng)種植的青藜一號中槲皮素含量最高，原產(chǎn)地玻利維亞的藜麥中山柰酚含量最高，這可能與藜麥品種及其產(chǎn)地的海拔、氣候、土壤條件等有關(guān)[16]。

由于藜麥籽實(shí)的外殼中含有大量的皂苷類物質(zhì)[17-19]，味苦澀且為有抗?fàn)I養(yǎng)的作用，因此，使用前需先除去藜麥外殼[20]，常采用的方法有水洗、研磨和混合法。水洗法由于產(chǎn)生大量的污水而不適合現(xiàn)代工業(yè)加工生產(chǎn)；研磨法由于加工過程中為徹底除去藜麥外殼長時(shí)間研磨產(chǎn)生高溫而破壞了藜麥中的活性成分，同樣不適合藜麥的生產(chǎn)加工。采用短時(shí)研磨加水洗的混合法，通過短時(shí)研磨除去大部分藜麥外殼，再用一定溫度的水洗滌藜麥籽實(shí)，徹底除去殘余的藜麥外殼，這種混合處理的方式既不會產(chǎn)生高溫也不會產(chǎn)生大量的污水，是一種理想的藜麥加工方法。本研究通過測定水洗法和混合法加工后藜麥中槲皮素和山萘酚的含量發(fā)現(xiàn)，混合法加工過后的藜麥中槲皮素含量稍有降低，降低了約7%，山萘酚含量不但沒有降低反而比水洗法高，提高了約28%，這可能與藜麥加工時(shí)產(chǎn)生的熱量促進(jìn)了山萘酚的生成有關(guān)。

測定了藜麥籽實(shí)、葉、莖稈和種皮中槲皮素和山萘酚的含量，其中，藜麥葉片中槲皮素和山萘酚的含量最高，莖稈中2種物質(zhì)的含量最低。說明藜麥葉片作為植物的營養(yǎng)器官[21]，黃酮類物質(zhì)含量較高，而莖稈是植物的結(jié)構(gòu)支撐器官，其所含的黃酮類物質(zhì)很少。研究結(jié)果為今后藜麥植物的綜合開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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