兼具解磷解鉀功能生防菌分離鑒定及效果評價

代 志，高俊明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801）

農(nóng)藥化肥的大量投入和使用曾對確保我國糧食生產(chǎn)和菜籃子工程大力發(fā)展發(fā)揮了積極重要的作用。但多年來，我國農(nóng)藥、化肥使用效率偏低、過量和不合理施用現(xiàn)象極為普遍，由此帶來的副作用也越來越突出，如土壤出現(xiàn)板結(jié)、酸化、肥力下降，土壤微生態(tài)失衡，有害生物抗藥性產(chǎn)生，病蟲草害頻發(fā)，環(huán)境污染、農(nóng)產(chǎn)品有害物質(zhì)殘留超標(biāo)等已嚴(yán)重影響到了我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-2]。為此，國家提出了減肥控藥確保農(nóng)藥化肥零增長行動方案，為我國今后農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定了方向。而在新形勢下，如何確保糧食、蔬菜等主要農(nóng)產(chǎn)品供給，實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥、化肥減量提效、控害[3]，就成為農(nóng)業(yè)科技領(lǐng)域面臨的重要問題。

已有研究表明，土壤中不僅存在能夠降解礦物質(zhì)、促進(jìn)土壤中難溶性磷鉀釋放的有益微生物群，也存在著能夠抑制和殺死有害生物的有益微生物[4-6]。充分開發(fā)利用這些有益微生物資源是實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥、化肥減量提效的一條重要途徑。但目前對這類有益微生物資源的開發(fā)利用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，菌肥工作者只注重了能夠改善土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤肥力的微生物篩選；生防工作者則只注重有生防活性微生物的篩選[7]，這極大地影響了有益微生物資源在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。

本研究以山西省普遍嚴(yán)重發(fā)生的根結(jié)線蟲為靶標(biāo)生物，在篩選根結(jié)線蟲生防菌的過程中增加了解磷釋鉀活性測定環(huán)節(jié)，以期能夠篩選到兼具菌肥功能的根結(jié)線蟲生防菌，為今后多功能微生物生防菌和復(fù)合微生物菌肥研發(fā)及廣泛應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究中分離篩選根結(jié)線蟲生防菌的土樣采自山西太谷縣侯城鄉(xiāng)根結(jié)線蟲病連年嚴(yán)重發(fā)生的溫室內(nèi)土壤。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多功能生防細(xì)菌的分離和篩選

1.2.1.1 土樣采集 土樣采集時首先選擇根結(jié)線蟲病嚴(yán)重發(fā)生且近期又未使用任何農(nóng)藥的黃瓜或番茄大棚，進(jìn)入溫室后隨機(jī)選擇10個根結(jié)線蟲病發(fā)生相對較輕的采樣點(diǎn)，每點(diǎn)0.25 m2，除去表層干土，采集5～20 cm根際土壤，裝入塑料袋編號后帶回實(shí)驗(yàn)室，低溫（4℃）冷藏以備分離。

1.2.1.2 土壤細(xì)菌的分離 取土壤樣品1.0 g，放入100 mL無菌水中，用玻璃棒攪拌均勻，靜置30 min，將土樣溶液分別稀釋 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，倒置放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待平板中長出菌落，用接菌環(huán)將不同形態(tài)和顏色的單個菌落轉(zhuǎn)接到新的空白NA培養(yǎng)平板中純化培養(yǎng)，培養(yǎng)后接種到試管中，于4℃冰箱保存。

1.2.1.3 解鉀菌株篩選 將1.2.1.2中分離到的細(xì)菌菌株，分別先在NA培養(yǎng)平板活化培養(yǎng)48 h，然后將活化后的新鮮菌株用接菌環(huán)十字劃線法接種到不含游離鉀元素解鉀平板中培養(yǎng)，若正常生長，表明該菌可利用含鉀礦石。

解鉀平板培養(yǎng)基：蔗糖 2.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO41.5 g，鉀長石粉 5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2.1.4 解磷菌株的篩選 將1.2.1.3中篩選得到的能在解鉀培養(yǎng)平板中生長的菌株再轉(zhuǎn)接到解無機(jī)磷和解有機(jī)磷培養(yǎng)平板中，倒置放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d，從中挑選菌落周圍有溶解圈產(chǎn)生的菌株，然后轉(zhuǎn)到試管中，4℃冰箱保存。

解無機(jī)磷平板培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.2 g，CaCO32.5 g，葡萄糖 2.0 g，MnSO40.02 g，F(xiàn)eSO40.02 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

解有機(jī)磷平板培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.2 g，CaCO32.5 g，葡萄糖 2.0 g，MnSO40.02 g，F(xiàn)eSO40.02 g，卵磷脂 0.2 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2.2 解磷釋鉀菌株殺線蟲能力測試

1.2.2.1 根結(jié)線蟲分離 采用淺盤法分離根結(jié)線蟲。稱取土樣200 g左右平鋪在墊有雙層面巾紙的篩盆中，然后將篩盆放入不銹鋼托盤中，沿邊緣倒入清水至沒過土壤，靜置48 h，移去篩盆，然后將托盤中的水緩緩倒入到0.020 mm網(wǎng)篩中過濾，過濾至50 mL左右倒入離心管中待用。

1.2.2.2 解磷釋鉀菌株殺線蟲能力測試 將分離得到的解磷釋鉀菌株接入到NB培養(yǎng)基中，放入搖床中，在180 r/min，37℃條件下培養(yǎng)48 h。將細(xì)菌發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心5 min，吸取上清液2 mL加入到貝式培養(yǎng)皿中，挑入經(jīng)消毒過的根結(jié)線蟲（0.3%次氯酸鈉溶液處理3 min，無菌水沖洗3次過濾）30只，以加入未接菌的NB培養(yǎng)基的根結(jié)線蟲平板為對照，試驗(yàn)重復(fù)3次，在24，48 h分別記錄死亡線蟲數(shù)量，并計(jì)算死亡率及校正死亡率[8]。校正死亡率＝（處理某時刻線蟲死亡率－對照某時刻死亡率）/（1－對照某時刻死亡率）×100%。

1.2.3 液體培養(yǎng)解磷解鉀效果測定 采用無機(jī)磷液體培養(yǎng)基、有機(jī)磷液體培養(yǎng)基、鉀細(xì)菌液體培養(yǎng)基分別對分離出的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，對分解磷鉀活性進(jìn)行進(jìn)一步測定。

無機(jī)磷液體培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.2 g，Ca3（PO4）210.0 g，CaCO30.5 g，葡萄糖 2.0 g，MnSO40.02 g，F(xiàn)eSO40.02 g，蒸餾水1 000 mL。

有機(jī)磷液體培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O0.5 g，NaCl 0.2 g，卵磷脂 0.2 g，CaCO30.5 g，葡萄糖 2.0g，MnSO40.02g，F(xiàn)eSO40.02g，蒸餾水 1000mL。

鉀細(xì)菌液體培養(yǎng)基：（NH4）2SO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.1 g，Na2HPO42.0 g，蔗糖 10 g，酵母粉0.5 g，鉀長石粉10.0 g，蒸餾水1 000 mL。

接種菌株后，搖床程序設(shè)置為37℃，180 r/min培養(yǎng)6 d，用過氧化氫法測定菌液中可溶性鉀的含量[9]，采用鉬銻抗比色法測定菌液中可溶性磷的含量[10-12]。

1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 對分離到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色（參照葉生梅等[13]的細(xì)菌芽胞染色方法改進(jìn)研究）、鞭毛染色（參照顧冠彬等[14]細(xì)菌的5種鞭毛染色方法比較研究），對其不同的形態(tài)特征進(jìn)行鑒別。

1.2.4.2 生理生化鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對其進(jìn)行以下生理生化鑒定：糖發(fā)酵、甲基紅、接觸酶、V-P測定、水解淀粉、利用檸檬酸鹽、利用丙酸鹽、苯丙氨酸脫氨酶、卵磷脂酶、硝酸鹽還原、形成吲哚、耐鹽試驗(yàn)、氧化酶、膿青素、明膠液化、酯酶、生長溫度測定、精氨酸雙水解酶、葡萄糖利用[15]。

1.2.4.3 分子鑒定 將不同菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)后，取1 mL加入到1.5 mLEP管中，使用細(xì)菌抽提試劑盒將分離得到的菌株全基因組抽提出后，再利用細(xì)菌促旋酶gyrB基因[16-18]將其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物后送公司測序，并將序列結(jié)果輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

2.1.1 解磷釋鉀菌株的初篩與純化 利用稀釋涂布法從采集到的10份土壤樣品中共分離得到83株細(xì)菌菌株，根據(jù)分別可生長于難溶無機(jī)磷、有機(jī)磷和解鉀培養(yǎng)基上的菌株菌落形態(tài)及產(chǎn)生的溶解圈，從83株菌株中共分離純化得到5株解有機(jī)磷解鉀菌株（編號 TD-02-9，TD-04-4，TD-05-4，TD-05-7，TD-10-3）和4株解無機(jī)磷解鉀菌株（編號 TD-02-7，TD-05-8，TD-09-3，TD-10-6）。

2.1.2 菌株殺線蟲測定結(jié)果 篩選結(jié)果列于表1。

表1 3種菌株殺線蟲結(jié)果 %

試驗(yàn)共測試了上述分離篩選得到的9株解磷釋鉀菌株的抑殺線蟲死亡率及校正死亡率，其中在作用48 h后有3株菌株對線蟲抑殺校正死亡率在50%以上，分別為 TD-02-9，TD-05-7，TD-10-6。以此3株菌株為供試菌株，測定其液體發(fā)酵解磷解鉀效果及菌株鑒定。

2.1.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)解磷解鉀效果測定 利用過氧化氫法和鉬銻抗比色法分別測定3種供試菌株發(fā)酵液中可溶性磷和可溶性鉀的含量，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，菌株TD-10-6解有機(jī)磷和無機(jī)磷能力分別達(dá)到3.66，61.80 mg/L，明顯高于菌株TD-02-9和菌株TD-05-7；在解鉀效果方面，菌株TD-05-7和菌株TD-02-9解鉀能力分別達(dá)到8.74，8.17 mg/L，均高于菌株TD-10-6的6.72 mg/L。

表2 液體培養(yǎng)解磷解鉀效果測定 mg/L

2.2 3種解磷菌株的鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)特征

2.2.1.1 菌落形態(tài) 菌株TD-10-6在NA培養(yǎng)基上生長出的菌落形態(tài)為白色不透明膿狀，邊緣整齊，表面光滑（圖1）；菌株TD-05-7菌落形態(tài)為白色不透明薄膜狀，邊緣粗糙（圖2）；菌株TD-02-9菌落形態(tài)為淡黃色乳狀物，表面光滑有黏性（圖3）。

2.2.1.2 革蘭氏染色 經(jīng)過革蘭氏染色試驗(yàn)表明，菌株 TD-05-7（圖 4）和菌株 TD-02-9（圖 5）染色結(jié)果顯示藍(lán)紫色，屬革蘭氏陽性菌；菌株TD-10-6（圖6）染色結(jié)果為紅色，屬革蘭氏陰性菌。

2.2.1.3 芽孢染色 從染色結(jié)果可以看出，菌株TD-05-7（圖 7）和菌株 TD-02-9（圖 8）芽孢端生，單菌形態(tài)為長棒狀。

2.2.1.4 鞭毛染色 對3種菌株鞭毛染色試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株TD-05-7（圖9）為單鞭鞭毛，菌株TD-10-6（圖 10）為周生鞭毛，菌株 TD-02-9（圖11）周圍有2根鞭毛。

2.2.2 菌株生理生化特征 菌株TD-02-9，TD-05-7，TD-10-6生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果列于表3。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》得出，菌株TD-02-9和菌株TD-05-7分別與芽孢桿菌屬中解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌生理生化特征基本一致，菌株TD-10-6與假單胞菌中惡臭假單胞菌生理生化特征一致，因此，鑒定菌株TD-02-9為解淀粉芽孢桿菌，菌株TD-05-7為地衣芽孢桿菌，菌株TD-10-6為惡臭假單胞菌。

2.2.3 菌株分子鑒定結(jié)果 基于促旋酶gyrB基因擴(kuò)增序列的比對分析，結(jié)果顯示，菌株TD-02-9和菌株TD-05-7與Bacillus屬的其他序列有較高的相似性，菌株TD-10-6與Pseudomonas屬的序列有較高相似性。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株TD-05-7親緣關(guān)系與CP021677.1 Bacillus licheniformis最近（圖12），菌株TD-02-9親緣關(guān)系與DQ309309.1 Bacillus amyloliquefaciens最近（圖13），菌株TD-10-6親緣關(guān)系與 D86010.1 Pseudomonas putida親緣關(guān)系最近（圖14）。因此，鑒定菌株TD-05-7為地衣芽孢桿菌，菌株TD-02-9為解淀粉芽孢桿菌，菌株TD-10-6為惡臭假單胞菌。

表3 3種供試生理生化試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究通過從溫室土壤中篩選得到3種兼具解磷釋鉀多功能生防菌株，通過鑒定，其中2株為芽孢桿菌，1株為假單胞菌。經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行解磷解鉀效果測定，結(jié)果顯示，3種菌株的解有機(jī)磷結(jié)果為0.82～3.66 mg/L，解無機(jī)磷結(jié)果為40.90～61.80 mg/L。利用火焰分光光度計(jì)測得3種菌株分解無機(jī)鉀的結(jié)果為6.72～8.74 mg/L。假單胞菌解無機(jī)磷和有機(jī)磷能力明顯高于2株芽孢桿菌；而在解鉀能力上，2株芽孢桿菌大于假單胞菌。在進(jìn)行平板篩選的過程中，只觀察到菌株TD-02-9和菌株TD-05-7在有機(jī)磷平板中出現(xiàn)溶解圈，未在無機(jī)磷平板培養(yǎng)中出現(xiàn)溶解圈；而菌株TD-10-6恰恰相反，在無機(jī)磷平板中出現(xiàn)溶解圈，在有機(jī)磷平板中未出現(xiàn)溶解圈。但是液體發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行解磷效果測定發(fā)現(xiàn)，菌株TD-10-6同樣具有解有機(jī)磷的作用，而且解有機(jī)磷能力明顯大于2株芽孢桿菌的能力，分析原因可能是由于菌株TD-10-6在液體培養(yǎng)中更容易繁殖，因而，解有機(jī)磷能力大大提高。

本研究提供了3株細(xì)菌的解磷解鉀屬性及對根結(jié)線蟲的抑殺效果，后續(xù)試驗(yàn)還會對分離篩選得到的菌株進(jìn)行田間作物促生及防病效果的研究。同時，本試驗(yàn)存在一些不足，植物生長不僅受土壤中磷鉀離子的影響，微生物代謝產(chǎn)物中含有的生長素、生物降解酶等有機(jī)化合物同樣會影響植物的生長和體內(nèi)代謝平衡[19-20]。因此，還需要進(jìn)一步測定菌株分泌物當(dāng)中含有哪些具有植物促生作用的活性物質(zhì)及含量，為今后多功能微生物生防菌肥的研發(fā)和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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