HPLC法同時(shí)測(cè)定養(yǎng)心氏片中9個(gè)指標(biāo)性成分

上海東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海　200438

養(yǎng)心氏片是由十三味中藥組成的復(fù)方制劑，處方包含黃芪、淫羊藿、黃連、炙甘草、黨參、山楂、醋延胡索、丹參、地黃、靈芝、葛根、當(dāng)歸和人參。具有扶正固本、益氣活血、行脈止痛的功效，常用于氣虛血瘀型冠心病、心絞痛、心肌梗塞及合并高血脂、高血糖等癥[1-2]。養(yǎng)心氏片所含的活性成分如黃酮類成分葛根素、大豆苷、蘆丁、芹菜素均有明顯的擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，保護(hù)心肌缺氧性損傷的作用[3]；生物堿類成分延胡索乙素有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛的作用[4]；酚酸類成分丹參素有活血化瘀的功效[5]。

目前養(yǎng)心氏片的研究多為臨床應(yīng)用方面的報(bào)道，與含量測(cè)定相關(guān)的研究多為其中單個(gè)成分的測(cè)定，如黃芪甲苷和葛根素的測(cè)定[6-9]，2015版《中國藥典》含量測(cè)定項(xiàng)下僅有黃芪甲苷的HPLC測(cè)定。單個(gè)成分的測(cè)定作為養(yǎng)心氏片的質(zhì)量控制不夠全面。而由于組分復(fù)雜，同時(shí)測(cè)定其中的黃酮類、生物堿和酚酸類難度較大，目前亦未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了養(yǎng)心氏片中9個(gè)指標(biāo)性成分，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，為養(yǎng)心氏片的質(zhì)量控制及后期的作用機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1　儀器與材料

1.1儀器Agilent 1100高效液相色譜儀(含G1379A真空脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1367A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測(cè)器，美國安捷倫公司)；KUDOS- SK2200H超聲發(fā)生器(上海科導(dǎo)超聲儀器公司)；METTLER AE240型十萬分之一電子天平(德國梅特勒公司)。

1.2材料葛根素(批號(hào)：110752-201615)、大豆苷(批號(hào)：111738-201603)、丹參素(批號(hào)：110855-201614)、蘆丁(批號(hào)：100080-201610)、延胡索乙素(批號(hào)：110726-201618)、淫羊藿苷(批號(hào)：110737-201516)、芹菜素(批號(hào)：111901-201603)、人參皂苷Rd(批號(hào)：111818-201603)、阿魏酸(批號(hào)：110773-201614)購自中國食品藥品檢定研究院(純度>98%)；養(yǎng)心氏片(批號(hào)：150406，上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司)；色譜級(jí)甲醇購自Burdick&Jackson公司，色譜級(jí)乙腈購自Merck公司，色譜級(jí)甲酸購自Fluka公司，水為純化水，其余試劑為分析純。

2　方法和結(jié)果

2.1溶液的配制

2.1.1對(duì)照品溶液如表1所示，精密稱取如下樣品于2 mL 量瓶中，加入2 mL甲醇定容，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，存于4 ℃冰箱，待用。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各500 μL到10 mL 量瓶中，用甲醇定容，混勻，按照1∶2∶4∶8∶16∶32比例逐級(jí)稀釋，制得標(biāo)曲溶液。

2.1.3樣品溶液的制備取2片養(yǎng)心氏片樣品，剝除包衣放進(jìn)研缽碾碎，精密稱取1g置25mL量瓶中，加甲醇定容，超聲30 min，補(bǔ)足失重，過0.22 μm微孔濾膜，制得樣品溶液。

表1　對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

2.2色譜條件色譜柱：Agilent Plus-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：A乙腈- B水(含0.1%甲酸)，A相隨時(shí)間的變化：5%～40%(0～35 min)，40%(35～45 min)；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm、310 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；分析時(shí)間：35 min；柱后平衡時(shí)間：10 min?；旌蠈?duì)照品、養(yǎng)心氏片樣品的HPLC色譜圖如圖1所示。

2.3線性關(guān)系考察養(yǎng)心氏片中各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2　養(yǎng)心氏片中各化合物的線性關(guān)系

2.4精密度試驗(yàn)取2.1.1項(xiàng)下制備的系列混合對(duì)照品溶液，在1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次以及連續(xù)3d每天進(jìn)樣3次，根據(jù)所得峰面積分別考察日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果9個(gè)指標(biāo)性成分的日內(nèi)、日間精密度RSD均小于5%，表明該方法的精密度良好。

2.5定量限和檢測(cè)線考察將9個(gè)對(duì)照品溶液依次進(jìn)行稀釋，以信噪比10∶1時(shí)，確定其最低定量限；以信噪比3:1時(shí)，確定其最低檢測(cè)限。9個(gè)指標(biāo)性成分的最低定量限分別為5.00、5.50、8.50、8.00、6.25、8.00、5.50、6.00、5.00μg/mL；最低檢測(cè)限分別為2.50、2.75、4.25、4.00、3.13、4.00、2.25、3.00、2.50μg/mL。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取制備的養(yǎng)心氏片樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測(cè)定9個(gè)成分的峰面積，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果9個(gè)成分峰面積的RSD分別為2.25%、1.23%、3.84%、4.26%、1.02%、2.52%、1.37%、1.28%、4.63%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批次養(yǎng)心氏片1g，共6份，按2.1.3項(xiàng)下方法，分別制成樣品溶液進(jìn)樣分析。結(jié)果，養(yǎng)心氏片中9個(gè)成分含量的RSD均小于5%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批次養(yǎng)心氏片0.5 g，共6份，分別加入對(duì)照品一定量 (樣品中各成分含量的100%)，按2.1.3項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。9個(gè)成分的加樣回收率和RSD(n=6)分別為101.42%(RSD=1.48%)、102.74%(RSD=3.87%)、98.91%(RSD=1.67%)、199.35%(RSD=2.58%)、99.27%(RSD=3.27%)、98.59%(RSD=2.73%)、100.32%(RSD=3.42%)、102.53%(RSD=1.17%)、100.41%(RSD=3.63%)，回收率結(jié)果良好。

2.9樣品測(cè)定養(yǎng)心氏片中各化合物的含量通過線性方程計(jì)算。見表3。

表3　養(yǎng)心氏片中各成分的含量

3　討論

在色譜柱的選擇上，考慮到待測(cè)成分較多，極性差別大，為了提高分離度，選用了250 mm長(zhǎng)柱進(jìn)行分析。由于同時(shí)測(cè)定組分較多，未能保證所有峰分離度均>1.5，其中葛根素和蘆丁分離度>1.2，考慮到兩者含量較高，為指標(biāo)性成分，納入了測(cè)定項(xiàng)，后期考慮用MS法準(zhǔn)確定量。

在流動(dòng)相的選擇上，因各成分的參考流動(dòng)相比例不同，采用了乙腈-水體系，梯度洗脫，從結(jié)果看，各成分可同時(shí)檢測(cè)，分離度良好。在水相中加入甲酸可以防止葛根素、丹參素等成分出現(xiàn)拖尾峰，還可以抑制樣品解離[10]。在檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇上，由于各成分的最大吸收波長(zhǎng)各不相同，為了統(tǒng)一測(cè)定條件，并考慮到阿魏酸的特征吸收，同時(shí)選擇了254 nm和310 nm兩個(gè)波長(zhǎng)，其中310 nm測(cè)定阿魏酸，254 nm測(cè)定其余8個(gè)成分。

由樣品測(cè)定結(jié)果可見，養(yǎng)心氏片中多個(gè)活性成分含量穩(wěn)定，其中治療氣虛血瘀的藥如丹參、人參和葛根中所含的丹參素、人參皂苷Rd、葛根素的含量較高，符合本制劑的組方特點(diǎn)。本研究可同時(shí)測(cè)定養(yǎng)心氏片9個(gè)指標(biāo)性成分的含量，方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定可靠，可用于養(yǎng)心氏片的質(zhì)量控制。

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