木薯塊根類胡蘿卜素積累與主要基因表達譜分析

羅秀芹, 楊　龍,2, 肖鑫輝, 陳松筆

(1.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/農業(yè)部木薯種質資源保護與利用重點實驗室 海南 儋州 571737; 2.貴州省農業(yè)科學院亞熱帶作物研究所 貴州 興義 562400)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是世界三大薯類(馬鈴薯、甘薯、木薯)之一， 起源于熱帶美洲，廣泛栽培于熱帶和部分亞熱帶地區(qū)，是熱帶濕地低收入農戶的主要糧食，全世界約有10億人用木薯作食品，尤其是在非洲和拉丁美洲.我國于19世紀20年代引入木薯，首先在廣東高州一帶種植，目前已廣泛種植于我國廣西、廣東、海南、云南、福建和江西等熱帶、南亞熱帶地區(qū)[1].木薯因其適應性強，耐旱、耐貧瘠等優(yōu)勢而被廣泛種植.木薯塊根富含淀粉，高達為20%～30%，除作為食糧外，在化工、醫(yī)藥、紡織等方面均有重要作用，是淀粉及其深加工工業(yè)和動物飼料的重要來源，也是世界公認的一種很有發(fā)展?jié)摿Φ目稍偕茉醋魑?，具有使用的廣泛性和獨特性[2].然而，不同木薯品種塊根中也含有少量蛋白質和微量元素，如鐵、鋅和類胡蘿卜素.類胡蘿卜素具有多種生物學功能，尤其在保護人類健康方面起著重要的作用.其中類胡蘿卜素是合成維生素 A 的前體，具有多種生物學功能，尤其在保護人類健康方面起著重要的作用，能夠增強人體免疫力和具有防癌抗癌的功效.人體自身不能合成類胡蘿卜素，必須通過外界攝入，但類胡蘿卜素在許多植物中含量較低，并且很難用化學方法合成[3].木薯中類胡蘿卜素含量較低，其中90%的類胡蘿卜素為β-類胡蘿卜素[4].

類胡蘿卜素是一種烯萜類化合物，所有的類胡蘿卜素均通過類異戊二烯化合物或萜類化合物途徑合成.其中IPP(異戊烯焦磷酸)是該途徑的前體物質，IPP在IPP異構酶作用下生成DMAPP(二甲基丙烯基二磷酸)，然后再與3個IPP縮合依次生成GPP(牦牛兒焦磷酸)、FPP(法尼基二磷酸)、GGPP(牦牛兒焦磷酸).2個GGPP在PSY(八氫番茄紅素合成酶)作用下形成第1個無色的類胡蘿卜素—八氫番茄紅素.八氫番茄紅素經過連續(xù)的脫氫反應，共軛雙鍵延長，直至形成鏈孢紅素、番茄紅素.番茄紅素是類胡蘿卜素進一步合成代謝的分支點：一條途徑是在番茄紅素β-環(huán)化酶(LycB)的作用下產生β-胡蘿卜素；另一條途徑是在番茄紅素β-環(huán)化酶(LycB)和番茄紅素e-環(huán)化酶(LycE)的共同作用下合成α-胡蘿卜素[5-7].在α、β類胡蘿卜素的C4(C4′)位置引入羥基酮基和(或)C3(C3′)位置引入羥基以及在β環(huán)上引入C(5，6)-環(huán)氧基后，則形成結構更為復雜的含氧衍生物—葉黃素[8-11].而在另一分支途徑中β-類胡蘿卜素又經過一系列反應朝著ABA合成途徑方向合成ABA (圖1).

BCH:Carotene β-hydroxylase(胡蘿卜素β-環(huán)羥化酶)；CCS：Capsanthin-capsorubin synthase(辣椒紅素—辣椒玉紅素合酶)；CrtB：Phytoene synthase(八氫番茄紅素合酶)；CrtI：Phytoene desaturase(八氫番茄紅素脫氫酶)；CRTISO：Carotenoid isomerase(類胡蘿卜素異構酶)；DMAPP：Dimethylallyl pyrophosphate(二甲基丙烯焦磷酸)；ECH：Carotene ε-hydroxylase(胡蘿卜素ε-環(huán)羥化酶);GGPP:Geranylgeranyl pyrophosphate(牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸)；GGPS：GGPP synthase(牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶)；IPP：Isopentenylpyrophosphate(異戊二烯焦磷酸)；IPPI：IPP isomerase(異戊二烯焦磷酸異構酶)；LCYB：Lycopene β-cyclase(番茄紅素β-環(huán)化酶)；LYCE： Lycopene β-cyclase(番茄紅素ε-環(huán)化酶)；NCED：Nine-cisepoxy-carotenoid dioxygenase(VP14，9-順式—環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧合酶)；PDS：Phytoene desaturase(八氫番茄紅素脫氫酶);PSY:Phytoene synthase(八氫番茄紅素合酶)；VDE：Violaxanthin deepoxidase(堇菜黃質脫環(huán)氧化酶)；ZDS：ζ-carotene desaturase(ζ-胡蘿卜素脫氫酶)；ZEP：Zeaxanthin epoxidase(玉米黃質環(huán)氧化酶).圖1　類胡蘿卜素代謝途徑Fig.1　The pathway of carotenoids accumulation

類胡蘿卜素的合成受多基因調控，其中基因工程技術的在植物中的應用研究甚多，如水稻、油菜、馬鈴薯、番茄等[12-15]，但是在木薯中的研究較少.本研究在分析木薯塊根中類胡蘿卜素積累與主要基因的變化關系的基礎上，擬找到調控木薯塊根中類胡蘿卜素積累的關鍵基因，為今后用基因工程的方法提高木薯塊根中類胡蘿卜素含量提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1　材料

供試材料為5個顏色不同的木薯塊根SC101(白色)，SC5(乳白色)，BRA117315(粉紅色)，SC9(淺黃色)和BRA001554(黃色).5個木薯品種均在中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所儋州國家木薯種質圃種植10個月，收獲塊根后，清水洗凈，棄內外皮，切碎，每個品種每份約取1.0 g，各保存3份，液氮速凍后置于-80 ℃保存待用.

1.2　RNA的提取與定量PCR

研缽、研磨棒和勺子用200 ℃烘箱烘4 h，保存的樣品用液氮研磨至粉碎，稱取約0.1 g粉末參照植物總 RNA 提取試劑盒(天根生物技術公司)提取總RNA；反轉錄合成cDNA第一鏈參照反轉錄試劑盒cDNA第一鏈試劑盒(北京全式金生物技術有限公司).

通過GWAS測定華南9號(SC9)自然雜交后代群體F1代98份材料得到MeXAN和MeAO基因序列(數(shù)據(jù)待發(fā)表)以及結合基因組網站https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html查找出木薯β-類胡蘿卜素積累途徑中的關鍵酶基因序列并合成相應的定量PCR引物，包括合成代謝中的MePSY、MeCRTISO、MePDS、MeZDS和MeLCYB以及分解代謝中的MeBCH、MeVDE、MeNXS、MeXAN和MeAO，內參基因為ACTIN(表1).利用合成的cDNA第一鏈稀釋5倍為模板，用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TAKARA公司)進行PCR擴增.PCR反應體系為10 μL：cDNA1.0 μL，上下游引物各0.5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 5.0 μL，milliQ 3.0 μL.PCR反應條件：95 ℃預變性7 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；60 ℃ 30 s，60～95 ℃，20 ℃ 10 s.結果采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量.

表1　木薯類胡蘿卜素積累相關基因的定量PCR引物Table 1　The genes′ primer of carotenoids accumulation pathway in cassava for RT-PCR

1.3　β-類胡蘿卜素的提取與測定

提取方法參照王琴飛等[16]，選用種植10個月的SC101，SC5，BRA117315，SC9和BRA001554木薯塊根，用液氮研磨，稱取約0.3 g木薯塊根粉末于2 mL離心管中，加入400 μL預冷的超純水，100 μL飽和NaCl溶液和50 μL正己烷，渦混30 s，12 000 r·min-1，4 ℃離心2 min；加入200 μL二氯甲烷，渦混30 s，12 000 r·min-1，4 ℃離心2 min；加入800 μL乙酸乙酯，渦混30 s，12 000 r·min-1，4 ℃離心2 min，取上清過濾待測.β-類胡蘿卜素標品的配置：用二氯甲烷/正己烷(8/2)配置成單標母液，再用乙酸乙酯稀釋4倍，使用時用乙酸乙酯/二氯甲烷/正己烷(6/4/1)混合液配成不同濃度的混合標準溶液.HPLC的測定條件：波長450 nm，柱溫30 ℃，流動相甲醇/叔丁基甲醚(70/30)，流速1 mL·min-1，進樣量20 μL，運行時間18 min.

1.4　數(shù)據(jù)分析

β-類胡蘿卜素含量與基因表達量之間相關性分析采用SPSS軟件中的Pearson方法分析[17].

2　結果與分析

2.1　基因表達譜分析

定量PCR以SC101為對照，結果顯示了MePSY、MeCRTISO、MePDS、MeZDS、MeLCYB、MeBCH、MeVDE、MeNXS、MeXAN和MeAO的相對表達情況(圖2)，其中合成代謝中的MePSY、MePDS和MeLCYB以及分解代謝中的MeBCH、MeVDE和MeNXS隨著類胡蘿卜素含量的增加，其基因相對表達水平基本呈上升趨勢.

圖2　5個不同木薯品種塊根中類胡蘿卜素積累途徑相關基因表達Fig.2　The expression profile of ten genes in carotenoid accumulation pathway in five different cassava storage roots

2.2　β-類胡蘿卜素含量分析

圖3　5個不同木薯品種塊根中β-類胡蘿卜素含量Fig.3　The content of carotenoid in five different cassava storage roots

5個木薯品種SC101、SC5、BRA117315、SC9和BRA001554塊根類胡蘿卜素的測定結果如圖3，對應塊根顏色如圖4.結果表明，隨著塊根顏色加深其β-類胡蘿卜素含量呈上升趨勢.其中SC101純白色木薯塊根的β-類胡蘿卜素含量最低，SC9和BRA001554深黃木薯塊根的β-類胡蘿卜素含量都比較高，達到3.0 μg·g-1.

2.3　塊根類胡蘿卜素含量與基因表達量相關性分析

從表2可以看出，MePSY、MePDS、MeLCYB、MeVDE、MeNXS和MeAO與木薯塊根類胡蘿卜素含量呈正相關，其中MeLCYB與含量相關性最強，差異極顯著.而MeCRITISO、MeZDS、MeCHXB和MeXAN與類胡蘿卜素含量呈負相關.

A ：SC101;B：SC5;C：BRA117315;D：SC9;E：BRA001554.圖4　5個不同木薯品種塊根橫切面圖Fig.4　The cross section of five cassava storage roots

基因含量相關系數(shù)rMePSYMeCRITISOMePDSMeZDSMeLCYBMeCHXBMeVDEMeNXSMeXANMeAOβ-類胡蘿卜素0.104-0.3180.428-0.3690.995**-0.3650.1810.345-0.1970.086

1)**在0.01水平(雙側)上顯著相關.

3　討論

木薯塊根顏色豐富，不同顏色木薯塊根之間類胡蘿卜素含量不同.本研究結果顯示白色木薯塊根只含有微量類胡蘿卜素；粉紅色木薯塊根含有少量類胡蘿卜素；黃色或深黃色木薯塊根含較高的類胡蘿卜素.Grassmann et al[18]研究表明，不同根色與其類胡蘿卜素組分和含量有著密切的關系，如白色類型只含有微量類胡蘿卜素，黃色類型含有葉黃素和玉米黃質等，紅色類型主要含有番茄紅素和β-胡蘿卜素等.本研究結果與胡蘿卜和其他作物研究一致[19].通過HPLC和定量PCR結果表明，木薯塊根類胡蘿卜素含量是通過不同的基因表達調控的，其中類胡蘿卜素合成代謝中的MePSY、MePDS和MeLCYB在白色木薯塊根中表達量較低，在非白色木薯塊根中表達量較高，這3個基因都與類胡蘿卜素含量成正相關.而MeLCYB的表達隨著塊根顏色的加深呈遞增的趨勢，其中MeLCYB基因表達與相關系數(shù)達到0.995，差異達到極顯著水平，說明MeLCYB在木薯塊根中在類胡蘿卜素積累中起著重要的作用.類胡蘿卜素分解代謝合成中的MeBCH、MeVDE和MeNXS表達趨勢與類胡蘿卜素含量成負相關.王慧等人從基因表達水平跟類胡蘿卜素含量相關性分析發(fā)現(xiàn)胡蘿卜根中LCYE基因的表達量與胡蘿卜根中類胡蘿卜素含量之間達到顯著正相關，葉中LCYE表達量與葉黃素、總類胡蘿卜素含量之間呈負相關，說明LCYE對根中主要類胡蘿卜素的積累起著關鍵性作用，但作用方式可能存在不同[20].本研究中類胡蘿卜素合成與分解代謝基因表達與其含量之間呈非直接正相關與負相關關系，基因調控錯綜復雜，需要進一步驗證其在轉錄水平，蛋白質水平和代謝水平的調控.

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