跑臺訓(xùn)練對脊髓損傷大鼠運動功能及Notch信號通路的影響

孫　鵬　袁瓊嘉　趙衛(wèi)衛(wèi)　

(玉林師范學(xué)院體育健康學(xué)院，廣西　玉林　537000)

1成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)系2德陽市人民醫(yī)院康復(fù)科

脊髓損傷(SCI)是一類有極高致殘率和致死率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率呈年上升趨勢，由于SCI后復(fù)雜的生理病理及神經(jīng)系統(tǒng)再生的限制，目前仍缺乏有效的治療方式〔1〕。近些年來，隨著對康復(fù)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展及對損傷機(jī)制的不斷了解，運動訓(xùn)練成為目前臨床上對SCI治療不可缺少的一部分。運動訓(xùn)練能促進(jìn)營養(yǎng)因子的分泌表達(dá)、誘導(dǎo)神經(jīng)肌肉的塑性、改善脊髓局部血液循環(huán)、促進(jìn)突觸的正確聯(lián)系及軸突的再生，對于損傷后的功能恢復(fù)有重要作用〔2，3〕。很多研究采用運動訓(xùn)練提高SCI的治療效果，由于運動訓(xùn)練方法、損傷程度、訓(xùn)練強(qiáng)度、訓(xùn)練時間等多種因素，目前對各種運動訓(xùn)練的效果存在一定的爭議。本研究建立SCI大鼠模型采用跑臺訓(xùn)練對其運動功能進(jìn)行評分，并探討相關(guān)作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實驗動物成年雌性健康SD大鼠36只，體重260～300 g，均由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗室提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃～24℃，采取自由采食和飲水，并分籠飼養(yǎng)。

1.2主要試劑和儀器熒光定量試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takala；熒光定量PCR儀購自美國ABI；跑步訓(xùn)練器為自制。

1.3SCI模型的建立將10%水合氯醛按照300 mg/kg體重腹腔麻醉大鼠，麻醉成功后俯臥位固定于手術(shù)臺上，背部剪毛并消毒，以T10棘突為中心做后背部長約3 cm的正中切口，鈍性分離背部的皮下組織，用血管鉗固定，用血管鉗咬除T8椎板和棘突，充分暴露出T9節(jié)段的脊髓，使大鼠脊髓處于水平位。以T9相應(yīng)的區(qū)域為損傷區(qū)，以正中血管為中心，用一重量為10 g的砝碼沿玻璃導(dǎo)管垂直下落，造成脊髓急性挫傷。模型制作成功的標(biāo)志為大鼠的下肢回縮性撲動，尾巴痙攣擺動，被打擊的局部脊髓表面迅速出現(xiàn)淤紫色，術(shù)后雙肢僵硬，并出現(xiàn)完全癱瘓。之后逐層縫合并皮下注射2 ml生理鹽水，并連續(xù)3 d肌肉注射20萬U青霉素。術(shù)后每天上下午各進(jìn)行一次膀胱按摩協(xié)助排尿，直至形成反射性排尿為止。

1.4實驗分組模型制作過程中共死亡6只，剔除腸脹氣、泌尿系統(tǒng)感染等原因，剩余30只，隨機(jī)分為3組：SCI模型組、運動訓(xùn)練組和正常組(無脊髓損傷也不做訓(xùn)練)，每組10只。

1.5運動訓(xùn)練本研究采用跑臺訓(xùn)練。參照相關(guān)文獻(xiàn)〔4，5〕及預(yù)實驗的結(jié)果，運動訓(xùn)練在造模成功后的第2天開始，根據(jù)大鼠自身的狀況，跑臺速度設(shè)定為6～15 m/min，每天進(jìn)行30 min訓(xùn)練，分2次進(jìn)行，每次訓(xùn)練15 min，2次間隔5 min，5次/w。訓(xùn)練過程中如出現(xiàn)大鼠停滯不動時，適當(dāng)給予陰囊刺激，確保訓(xùn)練的正常進(jìn)行。大鼠每次訓(xùn)練前排空膀胱，訓(xùn)練后及時給予食物和飲水補(bǔ)充。

1.6運動功能評定分別在損傷前及損傷后的1、7、14、21、28 d對各組大鼠的運動功能進(jìn)行評定，采用BBB評分法〔6〕和改良Tarlow評分〔7〕兩項。

1.7Notch1、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子(Hes)1表達(dá)的檢測采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法。麻醉處理各組大鼠，手術(shù)截取以脊髓損傷部位為中心5 mm長度的脊髓組織，提取組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA。根據(jù)GenBank基因庫搜索出鼠Notch1、Hes1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)共3個基因的CDS序列，利用Primer premier6.0引物設(shè)計軟件設(shè)計Notch1、Hes1和GAPDH的RT-PCR引物，每個樣品設(shè)置6個重復(fù)孔，以cDNA為模板用實時熒光定量PCR儀對Notch1、Hes1和GAPDH基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下：Notch1上游引物：5′-CCTTTACCTGCCTCTGCC-3′，下游引物：5′-GTCCTGTGGTCCCCTTGA-3′。Hes1上游引物：5′-GAGGCTGCCAAGGTTTTT-3′，下游引物：5′-GGTGGGCTAGGGAGTTTATG-3′。GAPDH上游引物：5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物：5′-GACGCCAGTAGACTCCACGACA-3′。PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 10 min；95℃ 15 s；60℃ 60 s，72℃ 20 s，以上共40個循環(huán)。72℃延伸15 min，4℃保存。根據(jù)Ct值利用2-△△Ct法計算各基因mRNA相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1各組不同時間點BBB評分比較SCI模型組及運動訓(xùn)練組各時間點BBB評分均顯著低于正常組(均P<0.05)，運動訓(xùn)練組從14 d起B(yǎng)BB評分均顯著高于SCI模型組(均P<0.05)，見表1。

2.2各組不同時間點改良Tarlow評分比較SCI模型組及運動訓(xùn)練組在各時間點改良Tarlow評分均顯著低于正常組(均P<0.05)，運動訓(xùn)練組從14 d起改良Tarlow評分均顯著高于SCI模型組(均P<0.05)，見表2。

表1　各組不同時間點BBB評分結(jié)果分)

與正常組比較：1)P<0.05；與SCI模型組比較：2)P<0.05，下表同

表2　各組不同時間點改良Tarlow評分結(jié)果分)

2.3各組不同時間點Notch1、Hes1 mRNA相對表達(dá)量比較SCI模型組和運動訓(xùn)練組各時間點Notch1、Hes1 mRNA相對表達(dá)量均顯著高于正常組(均P<0.05)，運動訓(xùn)練組在各時間點Notch1、Hes1 mRNA相對表達(dá)量均顯著低于SCI模型組(均P<0.05)，見表3。

表3　各組不同時間點Notch1、Hes1 mRNA相對表達(dá)量

3　討　論

目前對SCI主要的康復(fù)治療為中醫(yī)針灸、運動訓(xùn)練、并發(fā)癥的康復(fù)治療、心理干預(yù)、物理因子、矯形器及輔助用具應(yīng)用等。運動訓(xùn)練是SCI后肢體功能恢復(fù)的重要措施。研究發(fā)現(xiàn)，SCI后何時進(jìn)行運動訓(xùn)練是有嚴(yán)格限制的，基本在損傷后的2 w至2月之間，若訓(xùn)練開始太晚，會由于有大量的死亡細(xì)胞及在局部損傷部位形成的膠紙瘢痕而影響治療效果〔8〕。也有研究發(fā)現(xiàn)，在SCI后開始訓(xùn)練太早可能會加重組織缺氧、缺血，進(jìn)一步加重?fù)p傷，認(rèn)為適當(dāng)?shù)匮悠谥委熓鞘直匾摹?〕。本研究中考慮到SCI后期損傷全身及局部就開始啟動復(fù)雜的繼發(fā)性損傷，其嚴(yán)重程度直接影響后期的功能恢復(fù)情況，且運動能改善局部微環(huán)境，因此，本研究在術(shù)后24 h即開始運動訓(xùn)練。目前對于SCI的運動訓(xùn)練主要包括主動訓(xùn)練、被動訓(xùn)練、電刺激訓(xùn)練等多種方式。跑臺訓(xùn)練為一種被動訓(xùn)練，研究證實其對SCI的功能恢復(fù)有一定療效〔10，11〕。

Notch信號通路是在進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞途徑，廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，由Notch受體和配體、下游效應(yīng)物、DNA結(jié)合蛋白等組成，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及機(jī)體的發(fā)育等過程。研究顯示，Notch信號通路對于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化有重要影響，在SCI后的表達(dá)明顯增強(qiáng)〔12，13〕。電針對SCI的治療可能與Notch信號通路有關(guān)〔14〕。

綜上，跑臺訓(xùn)練可顯著降低SCI大鼠的BBB評分法和改良Tarlow評分，并下調(diào)Notch1、Hes1的表達(dá)，這說明跑臺訓(xùn)練對脊髓損傷大鼠治療可能通過抑制Notch信號通路起作用。

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11Nees TA，Tappe-Theodor A，Sliwinski C，etal.Early-onset treadmill training reduces mechanical allodynia and modulates calcitonin gene-related peptide fiber density in lamina Ⅲ/Ⅳ in a mouse model of spinal cord contusion injury〔J〕.Pain，2016；157(3)：687-97.

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