HPLC-DAD 法檢測鹽酸左旋咪唑注射液中左旋咪唑的含量＊

林仙軍，章榮葉，周芷錦，湯賽飛，王彬，陳曉林，陸春波

（1.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所 杭州 311101；2.臺州市屠宰管理所 浙江臺州 318000；3.浙江建安檢測研究院有限公司 杭州 310006)

鹽酸左旋咪唑是廣譜驅(qū)蟲藥和生物反應調(diào)節(jié)藥[1]，對牛、羊、豬、犬、貓和禽的胃腸道線蟲、肺線蟲及豬腎蟲病具有良好驅(qū)蟲活性[2-3]。鹽酸左旋咪唑注射液質(zhì)量標準收載于《中國獸藥典》2015 年版一部[4]，標準采用三氯甲烷萃取、高氯酸滴定法（非水測定法）進行含量測定，方法操作繁瑣、費時，高氯酸滴定液能與多種藥物反應，專屬性不高。檢測中所用試劑三氯甲烷、醋酐等對人體有危害性，對環(huán)境污染也較嚴重。

目前文獻報道測定鹽酸左旋咪唑含量的方法除高氯酸滴定法外，主要以高效液相色譜法為主，有測定飼料[5]、綿羊血漿[6]、豬雞組織[7]、鹽酸左旋咪唑粉[8]、復方鹽酸左旋咪唑注射液[9]和萬乳康[10]等各類樣品中鹽酸左旋咪唑的含量，以及鹽酸左旋咪唑原料中的有關(guān)物質(zhì)[11]，但目前尚未見高效液相色譜法（HPLC）測定鹽酸左旋咪唑注射液中左旋咪唑含量的報道。因此，本研究對完善鹽酸左旋咪唑注射液質(zhì)量標準有促進作用。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配DAD 檢測器（美國Agilent 公司）；AG-285 電子天平（Mettler公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER TOLEDO 320 酸度計（Mettler 公司）。

1.2 試劑與藥品

乙腈、甲醇均為色譜純，德國默克公司；磷酸、三乙胺、鹽酸、過氧化氫和氫氧化鈉均為分析純；水為超純水。左旋咪唑?qū)φ掌穪碓礊橹袊称匪幤窓z定研究 院， 批 號100167-201203，含量99.9%。鹽酸左旋咪唑注射液來源為浙江凱特道格藥業(yè)有限 公 司， 批 號 為20180901、20180902 和20180903，規(guī) 格 為10m L ∶0.25g。

1.3 對照品溶液和供試品溶液的配制

稱取左旋咪唑?qū)φ掌愤m量，精密稱量，用流動相超聲溶解并定量稀釋制成每1mL 中約含100μg 的溶液，搖勻，作為對照品溶液；精密量取供試品適量，用流動相超聲溶解并定量稀釋制成每1mL 中約含100μg 的溶液，搖勻，作為供試品溶液。

1.4 標準曲線系列溶液的配制

取左旋咪唑?qū)φ掌愤m量，用流動相超聲溶解并稀釋制成每1m L 中含左旋咪唑500μg 的溶液，搖勻，作為對照品溶液。取對照品溶液適量，用流動相稀釋成濃度分別為1、5、20、50 和100μg/m L 的溶液。

1.5 高效液相色譜條件和系統(tǒng)適應性試驗

色 譜 柱：Agilent Eclipse XDB-C18，內(nèi)徑4.6mm，柱長250mm，粒徑5μm；用二極管陣列檢測器進行掃描，掃描范圍為190～400nm， 記 錄212nm 波 長處的色譜圖，流速：1.0m L/min；進樣量：10μL；柱溫：30 ℃；流動相為0.05mol/L 磷酸二氫鉀溶液（三乙胺調(diào)節(jié)p H 值至7.0）-乙腈（80 ∶20，v/v）。

1.6 非水滴定的方法

精密量取本品適量（約相當于鹽酸左旋咪唑0.25g），置分液漏斗中，加氫氧化鈉試液5m L，稍振搖后，精密加入三氯甲烷50m L，振搖提取。靜置分層后，精密量取三氯甲烷液25m L，加冰醋酸15m L、醋酐2m L 與結(jié)晶紫指示液1 滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定至溶液顯藍色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每1m L高氯酸滴定液（0.1mol/L）相當于24.08mg 的C11H12N2S·HCl。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線及線性關(guān)系考察

取1.4 項的溶液，按照建立的色譜條件進樣檢測，得到左旋咪唑?qū)φ掌啡芤荷V圖見圖1，光譜圖見圖2。以系列對照品溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，左旋咪唑在1～500μg/m L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程Y=44.190X+17.116，相關(guān)系數(shù)r=0.999 99。

2.2 穩(wěn)定性試驗

取批號為20180901 的左旋咪唑供試品溶液，分別于0、2、4、6、12 和24h 進行測定，測得左旋咪唑峰面積為RSD 為1.0%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3 HPLC-DAD法和非水法比較

分別用HPLC 法和非水法對實際樣品進行測定，數(shù)據(jù)見表1。實際樣品色譜圖見圖3，光譜圖見圖4。左旋咪唑的含量與非水測定法一致，相對偏差在1.0%以內(nèi)。

2.4 準確度

按照鹽酸左旋咪唑注射液配制方法，分別按2.5、5.0 和10.0mg/mL 三個濃度添加鹽酸左旋咪唑原料，每個濃度分別制備5 個平行樣品，求得添加回收率及相對標準偏差，測定結(jié)果見表2。

圖1 左旋咪唑?qū)φ掌啡芤?/p>

圖2 左旋咪唑?qū)φ掌啡芤簰呙韫庾V圖

圖3 左旋咪唑注射液供試品色譜圖（批號20180901）

3 討論和小結(jié)

1） 取標準曲線系列溶液中100μg/mL 對 照 品 溶 液， 在190～400nm 波長范圍內(nèi)進行DAD掃描。結(jié)果左旋咪唑在212 nm 的波長處有最大吸收，見圖2。因此，選擇212 nm 作為檢測波長。

2）用乙腈-水作為流動相時，左旋咪唑色譜峰拖尾較為嚴重。在流動相中加入三乙胺、磷酸、磷酸二氫鉀溶液等改進劑能夠抑制解離，改善峰形。本文考察了0.01、0.025 和0.05mol/L 等不同濃度的磷酸二氫鉀溶液，添加三乙胺調(diào)節(jié)p H 值為5.0、6.0 和7.0。結(jié)果磷酸二氫鉀溶液濃度低，峰形拖尾較嚴重，磷酸二氫鉀溶液濃度提高，色譜峰拖尾得到改善；p H 值越低，峰形越差，出峰時間越快；考察了乙腈的比例對保留時間的影響，乙腈的量15%的時候，保留時間約為40min；乙腈比例為20%時，保留時間約為16min，比較合適。

3）對左旋咪唑的穩(wěn)定性進行了研究，取左旋咪唑?qū)φ掌啡芤海舛?為500μg/mL）1.00mL， 分 別加1mol/L 鹽 酸 溶 液、1mol/L 氫氧化鈉溶液和5%過氧化氫溶液各1mL，放置12h，依法測定。結(jié)果左旋咪唑在這三種溶液中均穩(wěn)定，幾乎沒有降解。

4）對含量較低或者存在非法添加物干擾的左旋咪唑注射液樣品，非水滴定法多數(shù)無法準確測定其含量，而高效液相色譜法具有良好的專屬性，能夠準確測定左旋咪唑的含量，具有明顯的優(yōu)勢。因此，建立的方法可用于左旋咪唑的質(zhì)量控制。

5）高氯酸滴定液對溫度敏感，需要根據(jù)溫度做相應的校正，滴定體積較少，增加操作者的要求，滴定終點判斷需要看顏色決定，有一定的誤差；相對來說，高效液相色譜法操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定、可靠，更適用于實踐檢驗工作，值得推廣。■

圖4 左旋咪唑注射液供試品光譜圖（批號20180901）

表1 HPLC 法與非水法測定含量結(jié)果比較（n=3）

表2 回收結(jié)果（n=5）