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    鹽度對瘤背石磺血淋巴生理生化指標(biāo)及免疫應(yīng)激指標(biāo)的影響

    2018-04-16 05:45:07沈永龍陳威黃金田李強(qiáng)張明明
    水產(chǎn)養(yǎng)殖 2018年4期
    關(guān)鍵詞:鹽度淋巴生化

    沈永龍 ,陳威 ,黃金田 ,李強(qiáng) ,張明明

    由于瘤背石磺生活于潮間帶地區(qū),潮汐、降雨以及人類活動等均可導(dǎo)致潮間帶鹽度發(fā)生變化,從而給水生生物產(chǎn)生鹽度脅迫,大量實(shí)驗(yàn)研究表明,鹽度變化對水生動物生長存活、新陳代謝和滲透壓調(diào)節(jié)等具有顯著影響[1],同時(shí)環(huán)境脅迫對水生生物生理機(jī)能影響首先通過水生動物體內(nèi)血液生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)反映出來。有關(guān)環(huán)境鹽度影響水生動物血液生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)變化報(bào)道很多,一般認(rèn)為鹽度突變能夠?qū)е录讱游铩Ⅳ~類機(jī)體的免疫力下降。潘魯青等[2]對對蝦、李才文等[3]對日本對蝦的研究表明,鹽度突變使得生物體的血細(xì)胞數(shù)量降低,溶菌酶活性下降。貝類方面,馬洪明等[4]認(rèn)為鹽度突降會使櫛孔扇貝酸性磷酸酶活性升高。王帥等[5]報(bào)道了低鹽脅迫使得中國血蛤非特異性免疫酶活性降低,且長期會抑制某些非特異性免疫因子。因此,可以通過檢測不同鹽度組瘤背石磺血液成分的變化來評價(jià)瘤背石磺的健康狀況、營養(yǎng)狀況以及對環(huán)境鹽度的適應(yīng)狀況[6]。鑒于此,本文通過研究鹽度變化對瘤背石磺血液生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的影響,從而了解瘤背石磺對環(huán)境鹽度變化的適應(yīng)機(jī)制,為進(jìn)一步提高瘤背石磺的基礎(chǔ)理論研究提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動物

    試驗(yàn)用瘤背石磺為采自鹽城射陽河口區(qū)灘涂的同一批體質(zhì)健康個(gè)體,經(jīng)過150 mg/L KMnO4水溶液消毒5 min后采用鋪設(shè)底泥、搭置瓦片等模擬自然環(huán)境的方式進(jìn)行溫箱養(yǎng)殖,暫養(yǎng)馴化2 d備用。

    1.2 試驗(yàn)飼料

    以螺旋藻作為瘤背石磺的飼料,使用前粉碎均過100目篩,充分混合后作為飼料,晾干保存于冰箱中備用。飼喂時(shí)以海泥作為填充物質(zhì),海泥與螺旋藻粉按照5:1比例拌飼投喂。

    1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

    馴化結(jié)束后,選擇個(gè)體均一的健康瘤背石磺1 200 只,濕重為(2.96±1.02)g,隨機(jī)分成 5 組,分別用不同鹽度梯度(5、15、25、35 和 45)的人工海水飼養(yǎng)于特制的防逃養(yǎng)殖箱(70 cm×50 cm×40 cm)中,每組設(shè)置6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)40只。飼養(yǎng)期間所用海泥均為過200目篩絹網(wǎng)的海邊高潮帶表層泥土,將細(xì)海泥分別在不同鹽度梯度的海水中完全浸濕5 min后鋪設(shè)于養(yǎng)殖箱底部,厚約3 cm,然后將鋪有底泥的養(yǎng)殖箱傾斜30°放置,形成斜坡。在每個(gè)箱中噴灑2 L相應(yīng)鹽度梯度的海水,使其在坡底具有一定的積水,每日添加曝氣后的自來水維持積水量和箱內(nèi)濕度,同時(shí)調(diào)節(jié)水體鹽度,從而維持瘤背石磺生存環(huán)境中鹽度的穩(wěn)定。

    表1試驗(yàn)飼料配方和營養(yǎng)水平 (%,干物質(zhì)基礎(chǔ))

    試驗(yàn)期間箱內(nèi)氣溫控制為24~26℃、保持箱內(nèi)濕度88%~90%,每天兩次07:00和17:00用海泥與螺旋藻粉(m:M/20:1)拌飼投喂于固定位置的玻璃食臺,投飼率為2%。每次投喂前清潔養(yǎng)殖箱、食臺及瓦片,投喂后1 h清除殘餌并向養(yǎng)殖箱中分別噴灑不同鹽度梯度的海水,維持瘤背石磺體表濕潤和養(yǎng)殖箱內(nèi)的濕度。觀察記錄攝食情況并檢查防逃設(shè)施是否完好。飼養(yǎng)60 d后,從各處理組中隨機(jī)抽取瘤背石磺30只,采集組織樣本測定相關(guān)指標(biāo),取樣前禁食24 h。

    1.4 樣品制備及分析測定

    1.4.1 血淋巴生化指標(biāo) 飼養(yǎng)60 d后,禁食24 h。將從每個(gè)箱中隨機(jī)取得的瘤背石磺30只用肝素鈉溶液潤洗后的2 mL一次性注射器抽取血淋巴。采用心臟動脈抽血,取全血置于離心管中(含有少量已烘干的肝素鈉),測定總蛋白(TP,雙縮脲法)和白蛋白(ALB,溴甲酚綠法)含量。然后將全血3 500 r/min離心15 min制得血清,測定血清中甘油三酯(TG,甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶法)、膽固醇(CHOL,膽固醇氧化酶-過氧化物酶法)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT,賴氏法)、堿性磷酸酶(ALP,AMP法)及血糖(GLU,葡萄糖氧化酶法)含量。除血糖外,血淋巴生化指標(biāo)均采用美國倍肯公司生產(chǎn)的ABBOTTALOYON 300全自動生化分析儀進(jìn)行分析測定。1.4.2 免疫應(yīng)激指標(biāo) 首先取樣制備瘤背石磺血清(同1.4.1),然后分別用超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(測總)、過氧化氫酶(CAT)測試盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測試盒以及丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)分別測定不同鹽度組相應(yīng)招標(biāo)含量。每次測量設(shè)置空白對照管、標(biāo)準(zhǔn)對照管、測定管,分別設(shè)置三個(gè)平行。蛋白定量采用Bradford考馬斯亮藍(lán)法。

    SOD活力單位定義為:每1mL血淋巴在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為1個(gè)活力單位(U/mL)。CAT活力單位定義為:每1mL血淋巴每1s分解1μmol H2O2的量為一個(gè)活力單位(U/mL)。GSH的比含量定義為:每L血淋巴中GSH的含量(gGSH/L)。MDA的比含量定義為:每1mL血淋巴中MDA的含量(nmol/mL)。

    1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后,采用SPSS 16.0中的單因素方差分析(one-way ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并進(jìn)行Duncan氏多重比較。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE),P<0.05認(rèn)為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí),Excel作圖,得到各指標(biāo)值隨鹽度水平變化的柱狀圖,并將血淋巴各個(gè)指標(biāo)數(shù)值與增重率進(jìn)行相關(guān)性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 鹽度對瘤背石磺血淋巴生化指標(biāo)的影響

    由圖1可以看出,鹽度對瘤背石磺血液生化指標(biāo)的影響差異顯著。首先,從血清蛋白質(zhì)和血液中酶類指標(biāo)看,隨著鹽度的升高,瘤背石磺血清中的總蛋白、白蛋白和球蛋白含量變化趨勢一致,即低鹽度時(shí)隨著鹽度升高呈現(xiàn)下降趨勢,且各組之間差異明顯(P<0.05),而在鹽度35時(shí)又突然升高,后又下降。同時(shí),血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活性隨鹽度的升高變化趨勢稍有差異,但均隨著鹽度的升高呈現(xiàn)下降趨勢。谷丙轉(zhuǎn)氨酶在鹽度小于25時(shí),各組之間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但當(dāng)鹽度繼續(xù)升高后,谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著下降,而谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶均在鹽度大于15時(shí),其活性就顯著降低。其次,從糖類和脂類的代謝產(chǎn)物分析,鹽度對血糖和血脂的影響變化趨勢不同。血液中血糖含量隨著鹽度的升高呈現(xiàn)下降趨勢,且鹽度15、25和35組之間無顯著具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但顯著低于鹽度5組,顯著高于鹽度45組(P<0.05)。而血脂隨著鹽度的升高有一定的降低,但差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而膽固醇在血清中的含量呈現(xiàn)“波浪式”變化,且鹽度5、25和45組之間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖1瘤背石磺飼養(yǎng)環(huán)境鹽度水平與血液各生化指標(biāo)之間的關(guān)系

    續(xù)圖1瘤背石磺飼養(yǎng)環(huán)境鹽度水平與血液各生化指標(biāo)之間的關(guān)系

    2.2 鹽度對瘤背石磺免疫應(yīng)激指標(biāo)的影響

    本試驗(yàn)研究表明,鹽度對瘤背石磺某些免疫應(yīng)激有顯著影響。從圖2可以看出,過氧化氫酶在鹽度15時(shí)最高,且低鹽度時(shí)活性顯著高于高鹽度(P<0.05)。SOD與CAT相似,均在高鹽度時(shí)活性高,但不同的是,SOD在鹽度15時(shí)最高,在鹽度5組最低,且顯著高于和低于其他各組(P<0.05)。MDA含量與GSH相似,在低鹽度時(shí)含量顯著低于高鹽度(P<0.05)。GSH在隨著鹽度的升高,先降低再升高,但隨著鹽度的升高,其含量升高幅度較大。MDA含量在鹽度25時(shí)最高,其次是鹽度45組,其余三組之間無顯著影響(P>0.05)。

    圖2瘤背石磺飼養(yǎng)環(huán)境鹽度水平與血液各免疫應(yīng)激指標(biāo)之間的關(guān)系

    3 討論

    3.1 鹽度對瘤背石磺血淋巴生化指標(biāo)的影響

    血液生化指標(biāo)能夠反映水生生物健康狀況和生理狀況,可作為判斷生物體是否患病、患病類型和病情輕重的一種簡便依據(jù),它受內(nèi)外環(huán)境以及營養(yǎng)狀況等多種因素的影響[7-8]。鹽度是與水生生物存活和生長密切相關(guān)的環(huán)境因子之一,其對機(jī)體的影響間接表現(xiàn)為物質(zhì)交換和體內(nèi)能量的流動。在鹽度脅迫環(huán)境中,瘤背石磺必然需要消耗大量的能量——血糖來維持內(nèi)外環(huán)境的水鹽平衡。從本試驗(yàn)可以看出,在鹽度5時(shí),瘤背石磺血淋巴中血糖濃度最高,顯著高于其他各組,這與洪磊等[9]對許氏平鮋的研究結(jié)論相似,即血糖水平與鹽度脅迫強(qiáng)度呈一定的正相關(guān)性。但不同的是,在高鹽度時(shí),瘤背石磺血淋巴的血糖濃度較低,這可能是因?yàn)闈B透壓調(diào)節(jié)途徑不同低鹽度刺激誘導(dǎo)與糖異生作用相關(guān)酶活升高增加血糖濃度,而高鹽度誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的滲透壓調(diào)節(jié)途徑,同時(shí)也可能是瘤背石磺對于高滲溶液的滲透壓調(diào)節(jié)比低滲溶液更有效的原因。

    血脂是血漿中甘油三酯、膽固醇和類脂的總稱,是生命細(xì)胞基礎(chǔ)代謝的必需物質(zhì)。在正常情況下,機(jī)體中甘油三酯含量和膽固醇含量具有相關(guān)性[10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著鹽度的升高,瘤背石磺血淋巴中甘油三脂含量呈下降趨勢,但無顯著變化,這與黃曉榮研究鹽度對施氏鱘的影響結(jié)果一致,但甘油三脂隨鹽度的升高變化具有一定差異性,并不是隨著鹽度的升高呈現(xiàn)單一的先上升后下降趨勢,而是呈“波浪式”變化,具體原因還需進(jìn)一步研究。

    磷酸酶是生物體內(nèi)的重要代謝調(diào)控酶,也是溶酶體酶的重要組成部分,在貝類非特異性免疫中起到重要作用。王帥等[5]對血蛤的研究表明,鹽度脅迫對磷酸酶活性具有抑制作用,且堿性磷酸酶對鹽度的反應(yīng)比酸性磷酸酶小,且具有滯后性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,低鹽時(shí),瘤背石磺血淋巴中堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均較高,這可能是因?yàn)榈望}脅迫導(dǎo)致瘤背石磺某些器官,如肝臟,發(fā)生損傷,致使大量酶類釋放至血淋巴中。另外,從上面的白蛋白、球蛋白以及白球比可以看出,低鹽度和高鹽度時(shí),球蛋白含量顯著提高,白球比顯著降低說明鹽度脅迫已經(jīng)造成瘤背石磺免疫抑制作用。

    3.2 鹽度對瘤背石磺免疫應(yīng)激指標(biāo)的影響

    鹽度的變化不僅與水生生物的滲透壓調(diào)節(jié) (能量的平衡)、氧吸收和清除率相關(guān)[11-14],還對其免疫力有顯著影響,如改變鹽度能顯著降低日本囊對蝦、凡納濱對蝦等的血細(xì)胞的數(shù)量和非特異性免疫因子的含量,從而降低其免疫力[15-17]。貝類的體液免疫沒有特異性免疫,只有非特異性免疫,其抗氧化防御系統(tǒng)主要是由一些抗氧化因子構(gòu)成,主要包括SOD、GSH-PX、CAT、GSH 以及 MDA 等,它們聯(lián)合作用保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。另外,水解酶活性受外源刺激或脅迫的誘導(dǎo),這也可能是貝類具有可增強(qiáng)的抗性和對脅迫的耐受的原因。在水解酶類中,SOD和CAT是一類清除機(jī)體活性氧自由基的關(guān)鍵酶類,是抵抗超氧陰離子及其活性產(chǎn)物的第一道防線。正常情況下,機(jī)體的自由基含量處于動態(tài)平衡狀態(tài)。然而,環(huán)境脅迫時(shí)機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)的平衡將被打破,造成水解酶活性升高。因此,抗氧化酶活性的變化也用作于指示應(yīng)激的程度。對于CAT,本試驗(yàn)中,鹽度15時(shí)活性最高,高于或低于此鹽度均有所降低,說明長期的鹽度脅迫對CAT有一定的抑制作用。

    谷胱甘肽(GSH)在清除體內(nèi)自由基和損傷修復(fù)中起重要的作用,是細(xì)胞合成的重要的抗氧化劑。MDA是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物,間接反映出細(xì)胞可能被氧化甚至損傷的程度。有研究表明酸性環(huán)境可以促進(jìn)脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,瘤背石磺血淋巴MDA含量在鹽度25時(shí)最高,說明在此鹽度下,瘤背石磺脂質(zhì)過氧化作用明顯增強(qiáng),結(jié)合以上抗氧化酶活可以推斷,由于鹽度脅迫應(yīng)激造成的MDA積累可能主要由于活性氧過量產(chǎn)生和積累,同時(shí)活性氧的清除體系——抗氧化酶活性低造成的。

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